鼠重组腺病毒介导的骨形成蛋白-9转染大鼠牙囊干细胞的实验研究

目的：探讨鼠重组腺病毒介导的骨形成蛋白9基因转染大鼠牙囊干细胞的可行性及其转染后的成骨作用,以获得可用于牙周骨组织再生工程的基因修饰的种子细胞。方法：取大鼠下颌骨,解剖显微镜下体外分离培养纯化鉴定牙囊干细胞,腺病毒介导的骨形成蛋白9基因转染第三代牙囊干细胞,并设立空白对照组,绿色荧光病毒组（GFP组）。通过观察细胞形态及生长曲线变化,荧光显微镜及RT—PCR检测转染后骨形成蛋白9基因mRNA的表达,碱性磷酸酶及钙茜素红染色测定转染后牙囊干细胞的成骨活性。结果：与未转染对照组比较,转染组细胞转染2周后形成钙化结节,停滞期延长,数量轻度下降,倍增时间延长。牙囊干细胞转染骨形成蛋白9基因后12h后即有荧光表达,转染3,6,9,12d后骨形成蛋白9mRNA均呈阳性表达且逐渐增强,未转染对照组呈阴性。转染组碱性磷酸酶活性随转染时间的延长呈升高趋势,ALP染色及茜素红钙结节染色为阳性：未转染对照组碱性磷酸酶染色及钙茜素红染色均呈弱阳性表达,转染组显著高于未转染组。结论：鼠重组腺病毒介导的RBMP-9基因可以成功地转染大鼠牙囊干细胞,转染后牙囊干细胞高表达骨形成蛋白9,且具有明显的成骨作用。     

DN-ALK2对人乳腺癌细胞MDA-MB-231增殖、迁移和侵袭能力的影响

目的探讨DN-ALK2对人乳腺癌细胞MDA-MB-231增殖、迁移和侵袭能力的影响。方法 RT-PCR法检测MDA-MB-231细胞中ALK2基因mRNA的转录;分别以腺病毒DN-ALK2和RFP感染MDA-MB-231细胞,并设空白对照组,通过MTT法、平板集落形成试验、细胞划痕试验及Transwell侵袭试验检测细胞的增殖、集落形成、迁移及侵袭能力。结果 MDA-MB-231细胞中内源性表达ALK2。腺病毒DN-ALK2和RFP感染MDA-MB-231细胞36 h后,荧光表达量一致,约为70%。MDA-MB-231/DN-ALK2细胞中高表达DN-ALK2。与MDA-MB-231/RFP组相比,MDA-MB-231/DN-ALK2组细胞的增殖活力、集落形成率及划痕愈合率均显著降低(P<0.05),穿膜细胞数也明显减少(P<0.05);而MDA-MB-231/RFP组与空白对照组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论DN-ALK2可以在体外抑制乳腺癌MDA-MB-231细胞的增殖、迁移与侵袭。     

阻断ERK1／2蛋白激酶可促进BMP9诱导的C3H10T1／2细胞成骨分化

目的：初步分析丝裂原活化蛋白激酶家族成员ERKl／2在BMP9诱导间充质干细胞成骨分化中的作用及可能机制。方法：BMP9重组病毒感染巳H10T1／2细胞,Westemblot检测ERKl／2激酶的磷酸化。ERKl／2的特异性抑制剂PD98059阻断ERKl／2活性,细胞化学染色和活定量检测碱性磷酸酶（AlkalinePhosphatase,ALP）的表达情况;Westernblot检测骨桥蛋白（Osteopontin,OPN）表达,茜素红染色检测钙盐沉积情;荧光素酶报告基因实验检测srn日d经典途径的变化。RNA干扰抑制ERK1／2表达,分析其对-于BMP9诱导的C3H10T1／2细胞ALP活性和钙沉积的影响。结果：BMP9可以促进ERK1／2激酶的磷酸化;ERK1／2抑制剂PD98059可增强由BMP9诱导的c3H10T1／2细胞早期和晚期成骨化,并促进由BMP9诱导的Smad经典途径的活化;RNA干扰导致ERK1／2基因沉默同样也可促进BMP9诱导的QHIOT1／2细胞成骨分化。结：BMP9可以促进ERKI／2蛋白激酶的活化,而阻断ERK1／2蛋白激酶可进一步增强BMP9诱导的GH10T1／2细胞成骨分化。腺性况盐分论     

人S100A8重组腺病毒质粒的构建及鉴定

目的构建人S100A8(hS100A8)重组腺病毒质粒,为hS100A8的深入研究奠定基础。方法从pGST-hS100A8中扩增hS100A8片段,亚克隆至穿梭质粒pAdTrack-TOX,构建重组穿梭质粒pAdTrack-TOX-hS100A8。经酶切、PCR及测序鉴定,再经PmeⅠ酶切线性化后电转化感受态AdEasier细胞,获得重组腺病毒质粒pAdhS100A8,经PacⅠ酶切后转染至HEK293细胞进行包装,制备重组腺病毒,扩增后进行病毒滴度测定及RT-PCR和Western blot鉴定。结果重组穿梭质粒pAdTrack-TOX-hS100A8及腺病毒质粒pAdhS100A8经鉴定均构建正确;重组腺病毒AdhS100A8在HEK293中成功包装,扩增后病毒滴度为1011 IU/ml;hS100A8在HEK293细胞中成功表达。结论成功构建了hS100A8重组腺病毒质粒,为深入研究hS100A8奠定了基础。     

双氢青蒿素对骨肉瘤细胞143B影响的研究

目的：研究双氢青蒿素（Dihydroatemisinine,DHA）对人骨肉瘤细胞143B的影响及所导致的形态学变化。方法：采用人骨肉瘤143B细胞株,通过设置对照组和低浓度、中浓度、高浓度的DHA组,H．E染色观察Trandwell小室穿梭能力;划痕愈合实验观察迁移能力;Hoechst33258荧光染色检测细胞凋亡;MTT法检测细胞增殖抑制能力。结果：DHA表现出明显地抑制人骨肉瘤143B细胞的迁移、增殖以及促进凋亡（P〈0．05）,且伴随浓度的递增和时间的延长,抑制作用更明显。结论：DHA具有较强的抗入骨肉瘤作用,其机制可能与DHA诱导骨肉瘤细胞凋亡,并抑制其增殖有关。     

cAMP-PKA-CREB信号通路在骨形态发生蛋白9诱导小鼠间充质干细胞成骨分化中的作用

目的探讨cAMP-PKA-CREB信号通路在骨形态发生蛋白9(bone morphogenetic protein 9,BMP9)诱导小鼠间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)C3H10T1/2成骨分化过程中的作用及其机制。方法将C3H10T1/2细胞分别加入不同浓度的cAMP-PKA-CREB信号通路抑制剂H89(1、2.5、5和10μmol/L),检测其对碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性的影响;通过ALP定量和钙盐沉积试验分别检测H89对BMP9诱导C3H10T1/2细胞早期和晚期成骨分化的影响;经Western blot法检测H89对C3H10T1/2细胞中磷酸化CREB、骨钙素(Osteocalcin,OCN)和成骨关键转录因子Runx2表达水平的影响;通过Wentern blot及荧光素酶活性的检测,观察H89对经典信号通路BMPs-smad1/5/8的影响。结果随着H89浓度的增加,对BMP9诱导的C3H10T1/2细胞ALP的抑制作用明显增强(P0.05),且呈剂量依赖性;ALP定量和钙盐沉积试验结果表明,H89可明显抑制BMP9诱导的C3H10T1/2细胞早期及晚期成骨分化;H89可显著抑制BMP9诱导的C3H10T1/2细胞中磷酸化CREB、OCN及Runx2蛋白的表达(P0.05),与AdBMP9组比较,H89对经典BMPs-smad1/5/8信号通路无明显影响(P0.05)。结论阻断cAMP-PKA-CREB信号通路可抑制BMP9诱导的MSCs C3H10T1/2的成骨分化,为BMP9的临床应用奠定了理论基础。