60Co γ射线诱变选育聚谷氨酸高产菌株及培养基初步优化

对一株产γ-聚谷氨酸的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis CICC10099)进行了诱变筛选及摇瓶发酵条件的初步优化,以期得到γ-聚谷氨酸高产菌株并进一步提高其产能.实验考察了不同诱变剂量下的菌体的致死率和正突变率,以确定最佳诱变条件.结果表明:60Co γ射线最佳的诱变剂量为200 Gy时,致死率大于90 %,正突变率高达13.3 %.在上述剂量下,经60Co γ射线诱变后分离筛选得到一株高产突变株Bacillus licheniformis S16, 摇瓶实验表明γ-聚谷氨酸的含量达到16.9 g·L-1,较出发菌株CICC10099提高72.4 %.并且采用单因素法初步优化了摇瓶发酵培养基,优化后的培养基组成为:柠檬酸12 g·L-1,甘油80 g·L-1,氯化铵6 g·L-1,L-谷氨酸15 g·L-1,K2HPO4 1 g·L-1,CaCl2·2H2O 0.1 g·L-1 ,FeCl3·6H2O 0.05 g·L-1,MgSO4·7H2O 0.75 g·L-1,MnSO·H2O 0.1 g·L-1,pH 7.5;利用优化的培养基在250 mL三角烧瓶装液量50 mL, 37℃,180 r·min-1的条件下培养80 h,发酵液中的γ-PGA含量最高,可达到18.9 g·L-1.     

pH值控制下γ-氨基丁酸分批发酵动力学模型

在3.7 L发酵罐中研究短乳杆菌CGMCC NO.1306控制pH=5.0发酵生产γ-氨基丁酸(GABA)的过程。结果表明,γ-氨基丁酸的发酵过程大致分为菌体生长和产物合成2个阶段。基于Logistic方程和改进的Luedek ing-P iret方程,分2个阶段建立了控制pH=5.0的细胞生长、底物消耗以及GABA合成动力学模型,运用MATLAB 6.0软件处理实验数据和模型,拟合出描述发酵过程的模型参数。经验证,模型的拟合结果和实验值吻合较好,表明此动力学模型对指导GABA的发酵生产具有实际意义。     

导师制+学团制:生物科学人才培养模式探讨

结合浙江理工大学生命科学学院生物技术、生物制药专业及省级实验教学示范中心建设的情况,以教学改革为试点和动力,构建"导师制+学团制"的人才培养系统工程,发挥学生工作管理者、导师、学生的作用,有效实施并科学评价"导师制+学团制",以达到建立一套全新的生物科学人才培养模式之目的,培养理论知识扎实、实验动手能力强、综合素质高的优质人才。     

家蚕Argonaute2的表达分析及其结合RNA的初步研究

从家蚕cDNA文库中扩增到家蚕BmAGO2基因完整的ORF序列,通过Lasergene软件分析获得BmAGO2的抗原表位区(命名为Kago2),构建含Kago2的表达载体,转化大肠杆菌诱导表达,融合蛋白经镍柱亲和层析纯化后免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,ELISA和Western blotting检测抗血清的效价可达到1∶25 600以上,抗体特异性较好。表达谱分析结果显示,BmAGO2蛋白在家蚕卵期、蛹期、蛾期和五龄幼虫期均表达,但在蛹期表达量要偏低。而在五龄幼虫各组织中BmAGO2蛋白的表达差异较明显,BmAGO2蛋白在头部和表皮中大量表达,丝腺、马氏管和脂肪中也有少量表达,而在血淋巴、气管和中肠中未检测到该蛋白的表达。结合BmAGO2表达谱分析结果,进一步利用其抗体通过免疫共沉淀方法从BmAGO2蛋白表达量高的家蚕头部和表皮中分离出BmAGO2蛋白及结合的RNA,并逆转录成cDNA。以家蚕miRNA潜在的靶基因Bmem4,Bm(spl)-like,Bmemc,Bmmγ,Bmmβ2作为检测基因,荧光定量PCR分析获得的BmAGO2结合RNA,和对照组RNA相比,Bmem4,Bm(spl)-like,Bmemc,Bmmγ,Bmβ2基因在BmAGO2结合RNA中的含量分别富集了3.93、1.31、2.4、1.31、0.97倍。miRNA靶位点分析表明,Bmem4和Bmemc存在多个miRNA结合位点,极有可能是miRNA的靶基因。目前还没有有效的家蚕miRNA靶基因高通量鉴定方法,本实验为家蚕miRNA靶基因的高通量筛选提提供了可靠地实验途径。     

响应面法优化工程菌产细胞色素P450 BM-3的发酵条件

采用快速有效的数学统计方法对工程菌产细胞色素P450 BM-3的发酵条件进行了优化.首先利用Plackett-Burman设计从众多影响产P450 BM-3的因素中筛选出影响较大的4个因素：FeCl₃含量、诱导时机、诱导时间和接种量.在此基础上再利用响应面法中的杂合设计进行优化,通过拟合得到响应曲面函数,获得了最佳的实验条件.在该实验条件下,P450 BM-3酶活从37.6×10^-3U•ml^-1提高到57.9×10^-3U•ml^-1.     

芝麻香型白酒堆积过程微生物群落结构特征的PLFA分析

应用磷脂脂肪酸分析方法(PLFA)研究了芝麻香型白酒堆积过程微生物生物量和群落结构的变化。结果表明:在整个堆积过程,PLFA的种类和数量呈现一定的变化规律,可以反应微生物群落结构的变化。堆积过程中的优势PLFA是直链饱和脂肪酸和偶数碳不饱和脂肪酸。堆积的时间和温度对生物量的含量影响显著。同时,细菌是整个堆积过程的优势微生物菌群,革兰氏阴性菌是细菌中的优势菌群。而厌氧菌和好氧菌在不同的样品中差异较大。     

SA/NaCS-CaCl2/PMCG微胶囊固定化枯草杆菌HL-1发酵生产纳豆激酶

制备了海藻酸钠/纤维素硫酸钠-CaCl₂/聚亚基二胍氯化氢微胶囊（SA/NaCS-CaCl₂/PMCG微胶囊）,并以该微胶囊固定化培养枯草杆菌HL-1用于发酵制备纳豆激酶,考察了PMCG对枯草杆菌生长的影响,比较了微囊化培养与游离培养过程中的菌体生长、耗糖速率以及纳豆激酶产物分泌能力.最后经过连续6批培养,酶活可达到2465 IU•ml^-1,是游离培养过程的3倍.     

纳豆中纳豆枯草杆菌的筛选和纳豆激酶的分离过程研究

采用酪蛋白平板初筛一摇瓶复筛的筛选策略,从日本传统食品纳豆中筛选获得了一株高产纳豆激酶的纳豆枯草菌菌株,与国内公开报道的不同菌株相比,有更好的产酶能力。菌株经过液体发酵后获得含酶发酵液,采用硫酸铵盐析及Sephadex G-75凝胶层析、Sepharose CM Fast Flow离子交换层析对纳豆激酶进行了分离纯化,两步层析的纯化倍数和酶活回收率分别达到4．75、743％和1.32、77％,获得了纯度很高的纳豆激酶。     

γ-氨基丁酸液体发酵过程的条件优化及补料研究

为了提高γ-氨基丁酸(GABA)的发酵水平,在3.7 L发酵罐中考察了不同操作条件(通气和pH控制)对短乳杆菌CGMCC NO.1306分批发酵生产GABA的影响.结果表明,不同操作条件对GABA的发酵产量有显著影响.好氧发酵有利于菌体的生长,最大菌体干重达到2.78 g·L-1,而厌氧发酵有利于产物GABA的生成,发酵72 h时GABA的产量达到23.94 g·L-1.在兼性厌氧条件下,研究了pH控制对GABA分批发酵的影响,实验发现pH控制在5.0时,GABA产量最高,发酵72 h时GABA的产量达到40.73 g·L-1. 对GABA的补料发酵进行了初步研究,发酵108 h时GABA产量达到76.36 g·L-1,分别比摇瓶发酵、厌氧发酵以及控制pH 5.0发酵提高128.6%、219%和87.5%.     

家蚕小热休克蛋白22.6基因的生物信息学分析及其原核表达

小热休克蛋白家族成员在结构上变化很大,是细胞或生物体被多种类型的胁迫所诱导新合成的或含量增加的一类蛋白质,目前研究相对较少。从家蚕蛹期cDNA文库中获得一条序列,经过Blast比对和保守结构域分析后发现该蛋白属于家蚕小热休克蛋白,将其命名为BmHSP22.6;通过PCR扩增该基因的ORF序列,将其克隆到pET28a(+)表达载体的BamHⅠ和XhoⅠ酶切位点之间,获得重组质粒pET-28a-BmHSP22.6。该重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3),筛选获得工程菌,用终浓度为1 mM的IPTG诱导目的基因表达。用镍柱分离上清裂解液,获得纯化的目的蛋白。