Purification and Characterization of a New Ribosome Inactivating Protein from Cinchonaglycoside C-treated Tobacco Leaves

A new ribosome-inactivating protein （RIP） with a molecular weight of 31 kDa induced by Cinchonaglycoside C （1） designated CIP31, was isolated from tobacco leaves. Analysis of this protein sequence indicated that it belongs to the RIP family and it was distinct from the other plant RIPs reported previously at its N-terminal amino acid sequence. CIP31 can directly impair synthesis of coat protein （CP） of tobacco mosaic virus （TMV）, which resulted in inhibition of TMV long distance movement and multiplication in tobacco plants at concentrations of ng/mL. Furthermore, no toxicity was shown to the growth and fertility of the plants. CIP31 was synthesized only in the presence of Cinchonaglycoside C （1） and was independent of the salicylic acid （SA） signal pathway. We provided evidence for the SA-independent biological induction of resistance.     

烟草叶片愈伤组织形成过程中的细胞程序性死亡

以烟草叶片在MS培养基上诱导的10个不同时期的愈伤组织为材料,通过荧光染色显微观察到细胞核在形态上发生了缩缢变形,DNA Ladder检测也出现了标志细胞程序性死亡特征的DNA片断,表明了愈伤组织形成过程中发生了细胞程序性死亡（programmed cell death, PCD）,而在诱导的第六个时期（13 d）DNA的脱尾现象最为明显,表明这一时期是PCD发生较为活跃的时期。利用RT-PCR法在诱导的前九个时期,即诱导的第3、5、7、9、11、13、15、17、19 d的叶片的愈伤组织中均扩增出了细胞程序性死亡相关Beclin1基因的cDNA片段(678 bp),Northen杂交结果显示,在诱导的第13 d,类Beclin1基因表达较强。通过酶联免疫法测定诱导前14 d叶片中内源激素ABA的含量变化,在诱导的第六时期ABA含量相对达到了峰值,结果表明：在烟草叶片愈伤组织诱导过程中伴随PCD的发生,在此过程中内源激素ABA与Beclin1基因起到了调节作用。     

拉米夫定降低HBV转基因孕鼠血中HBV载量的初步研究

目的:观察HBV转基因小鼠孕期使用拉米夫定对降低母血HBV含量的作用及其对母胎安全性的影响,探讨孕期采用HBV抗病毒治疗,降低宫内感染发生率的可行性。方法:应用可高水平表达HBsAg的HBV转基因小鼠,分别从孕早期(孕第5天)和孕中期(孕第10天)开始给予拉米夫定(100mg/kg,天)直至分娩,对照组给予生理盐水。检测母鼠血中HBsAg、HBV DNA等感染指标的变化,同时从多阶段、多方面,用多指标观察妊娠期,尤其是妊娠早期,使用药物对母鼠、胎鼠及新生鼠安全性的影响。结果:21只孕期接受抗病毒药物的HBV转基因母鼠,无一例发现明显的毒性反应,对胎鼠无致畸作用,且不影响新生鼠早期生长发育,同时小鼠病毒DNA水平明显下降。结论:HBV转基因小鼠孕期服用拉米夫定可降低病毒负荷,有助于减少HBV母婴传播的危险性,且对母鼠及其子代的安全性无明显影响。     

不同调控序列作用下GUS基因在烟草中瞬时表达活性的研究

以pBI121为出发质粒, 利用烟草泛素启动子Ubi.U4、CaMV35S启动子以及Kozak序列构建4种GUS基因表达载体,通过叶盘转化法转化烟草叶片, 检测瞬时表达活性, 研究不同调控序列对外源基因表达的调控作用。结果表明: CaMV35S启动子附加Kozak序列后使GUS活性比独立使用CaMV35S提高了近2倍; 双CaMV35S启动子附加Kozak序列驱动GUS基因的表达活性与单CaMV35S附加Kozak序列相当; 烟草泛素启动子附加Kozak序列的表达活性为CaMV35S启动子附加Kozak序列的1.5倍; Ubi.U4-CaMV35S复合启动子附加Kozak序列驱动GUS基因表达水平最高, 其表达效率是双CaMV35S启动子附加Kozak序列调控下GUS表达效率的3倍, 为CaMV35S独立作用时的10倍。     

Rd29A启动子驱动AtCDPK1基因转化马铃薯的研究

为获得抗旱性强、生长正常的转基因马铃薯植株,以野生拟南芥生态型(Col-0)为材料,利用PCR和DNA重组技术,克隆了拟南芥Rd29A(responsive to dehydration)基因ATG上游+83bp至-1 441bp共1 524bp的启动子区域,其DNA序列与已知拟南芥Rd29A 5'端启动子序列同源性为100%;构建了Rd29A启动子驱动AtCDPK1基因表达的植物表达载体pCHFRd-CDPK1。以马铃薯品种‘费乌瑞它’的试管微型薯为材料,利用农杆菌介导法,将构建成功的pCHFRd-CDPK1载体转入马铃薯中,经筛选与植株再生,获得抗性再生植株。通过PCR和Southern blot检测显示,Rd29A启动子驱动的AtCDPK1基因已整合在马铃薯的基因组中。利用PEG模拟干旱胁迫后,经RT-PCR分析证实,当用20%的PEG胁迫转基因马铃薯植株时,Rd29A启动子驱动AtCDPK1基因表达的转基因马铃薯各个株系中AtCDPK1基因表达量明显增强,而在无胁迫的条件下,植株中AtCDPK1基因基本不表达;同时发现35S控制AtCDPK1转基因植株在PEG胁迫前后,基因转录未见明显差异。形态学观察还表明,在30%PEG胁迫下,转基因植株能正常生长,其长势优于未转基因的对照,且对照植株略有萎焉。该结果可为进一步利用逆境诱导型启动子驱动抗逆基因在农作物中的表达研究及其遗传改良提供依据。     

转Bt基因抗虫棉对蚯蚓行为、生长及代谢的影响研究

本研究以蚯蚓的趋避性行为、体重及瞬时生长速率、纤维素酶(EG、BG、CBH)为指标,以转Bt基因棉和常规非转基因棉苗期、花铃期和拔柴期的根部为实验材料,研究了转基因与非转基因棉花根对蚯蚓趋避性行为、生长速率和纤维素酶活性的影响。实验结果表明,蚯蚓对棉花根存在趋向性,棉花根可以增加蚯蚓的体重和瞬时生长速率,且可以提高蚯蚓纤维素酶的活性。转基因和非转基因棉花根对蚯蚓的影响无显著差异。     

林烟草蛋白激酶NsylCIPK3基因的克隆与功能分析

CIPK蛋白激酶家族(CBL-interacting protein kinase)是一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族,与类钙调磷酸酶B亚基CBL(calcineurin B-like protein)蛋白共同形成CBL-CIPK网络,在植物的生长发育和逆境胁迫响应过程中发挥重要作用。烟草中该家族的研究还比较少,本研究从林烟草(Nicotiana sylvestris)中获得一个CIPK家族基因,该基因与拟南芥和杨树中的CIPK3同源性分别为68.4%和87.5%,将其命名为Nsyl CIPK3。氨基酸序列分析表明,Nsyl CIPK3具有CIPK蛋白家族的典型结构特征,在N端和C端分别具有典型的激活环结构域和NAF结构域。进化树分析显示,Nsyl CIPK3属于CIPK蛋白亚家族Ⅱ。表达模式研究表明,该基因在林烟草的叶和腋芽中的表达量相对较高,在主根中的表达量次之,在侧根、茎、花瓣和萼片中的表达量相对较低,并且在烟草成熟期的叶中表达量明显升高。在高盐、紫外光和低钾胁迫下该基因的表达发生不同程度的上调。酵母双杂交结果显示,Nsyl CIPK3可与Nsyl CBL9互作。推测Nsyl CIPK3可能通过与Nsyl CBL9互作形成信号通路,激活下游靶蛋白,参与烟草响应非生物逆境胁迫的信号转导过程。     

VIGS技术在甜菜上的应用

病毒诱导基因沉默(VIGS)是一种应用于研究植物基因功能的反向遗传学手段。相对于基因敲除及转基因等方法,它具有时间短、成本低、高通量等优点。随着甜菜全基因组的测序完成,为尽早对大量序列信息进行注释和功能鉴定,急需建立甜菜VIGS体系。本文采用目前应用最广泛的烟草脆裂病毒载体在农杆菌的介导下侵染甜菜幼苗叶片,同时设立对照。提取甜菜幼苗叶片总RNA,并反转录成c DNA,设计特异引物进行RT-PCR检测。结果表明:在侵染植株上检测到了烟草脆裂病毒特异条带,证明该病毒可以对甜菜进行侵染,这一结果为下一步建立甜菜VIGS体系奠定了基础。     

烟草叶面积指数的高光谱估算模型

叶面积指数(1eaf area index,LAI)是重要的生物物理参数,亦是各种生态模型、生产力模型以及碳循环研究等的重要生物物理参量,因此具有重要的研究意义。为了探索不同高光谱模型监测烟草叶面积指数LAI的精度,在烟草伸根期,旺长期和成熟期采用ASD Fieldspec HH光谱仪测定了不同水氮条件下烟草冠层的高光谱反射率和叶面积指数数据。选用四个常用的植被指数RVI (ratio vegetation index)、NDVI (normalized difference vegetation index)、MTVI2（Modified second triangular vegetation index）、MSAVI（Modified Soil-adjusted vegetation index）和PCA (principal component analysis)、neural network (NN)三种方法对烟草LAI进行了估算,比较分析了三种方法的估算结果。研究结果表明,植被指数法,主成分分析,神经网络方法LAI都取得了较为理想的结果,其中植被指数法可以较为精确反演烟草LAI,验证模型确定性系数在0.76～0.85之间,主成分分析方法和神经网络方法精度较高,分别为0.938和0.889。主成分分析方法验证模型的稳定性更好,其验证模型的RMSE为0.172,低于四个植被指数和神经网络。MTVI2和MSAVI能较好地去除土壤、大气等条件影响,反演精度高于RVI和NDVI。与基于植被指数建立的模型相比,主成分分析和神经网络可以更好的提高LAI的反演精度。