响应面法快速优化曲霉Aspergillus sp.F044产脂肪酶培养条件

运用逐因子试验(Seriatim-Factorial Experiment)、Plackett-Burman、Response Surface Methodology(RSM)和单因子试验(Monofactorial Experiment)分析对产脂肪酶曲霉Aspergillus sp.F044产酶培养条件进行了快速优化。首先运用逐因子试验确定Aspergillus sp.F044产脂肪酶最适碳源和氮源,分别为麦芽糖和牛肉膏。在此基础上,通过Plackett-Burrman设计对影响其产酶相关因素进行评估并筛选出具有显著效应的橄榄油、牛肉膏、硫酸镁三个因素。然后通过实验拟合上述三因素与发酵液脂肪酶活力的一阶线性模型,沿着一阶模型给定的路径进行最速上升试验,在上升最高点处由中心组合试验和向应面分析确定其最优培养基组成;最后通过单因子试验确定最适发酵温度和摇床转速。试验优化的最优培养条件为:麦芽糖1.5%(w/v),硫酸铵7‰(w/v),磷酸氢二钾1‰(w/v),牛肉膏1.25%(w/v),硫酸镁2.11‰(w/v),橄榄油1.41%(v/v),自然pH,250r/min和30℃培养72h酶活达32.15U/mL。与初始11.18U相比,酶活提高2.88倍。     

微生物脂肪酶活性构像的形成及激活过程中的影响因子

微生物脂肪酶是一类具有重要应用价值的生物催化剂。作为一种胞外酶,其活性构像的形成及激活是一个高度复杂而特异性的生理过程。综述了作为微生物脂肪酶的结构成分,参与脂肪酶折叠和激活过程中的各种因子及其作用机制,这些因子包括脂肪酶特异性的折叠酶、脂肪酶激活因子、前序列、钙离子和二硫键等。     

假单胞菌脂肪酶的研究进展

脂肪酶是一种重要的工业用酶,来自于假单胞菌的脂肪酶较来自其它菌株的具有更强的温度、有机溶剂耐受性等比较优势,在有机合成、食品工业、药物制造、油脂深加工等工业应用方面应用潜力巨大。对假单胞菌脂肪酶的分类及性质、结构、表达调控和分泌机制等进行了简要的概述。     

枯草杆菌α-淀粉酶基因克隆及其在毕赤酵母中表达的初步研究

以B.subtilis XL-15基因组为模板,运用PCR法成功克隆了α-淀粉酶基因,其开放式阅读框(ORF)为1980bp,编码659个氨基酸残基。分别将该基因转入大肠杆菌BL21(DE3)和毕赤酵母GS115中,进行诱导表达。结果表明,大肠杆菌破碎上清液中未检出酶活,SDS-PAGE电泳分析显示表达产物均以无活性包涵体存在;而毕赤酵母在α-Factor及AOX1基因启动子和终止信号的调控下,经高密度培养,表达产物分泌至胞外,发酵液酶活力为4.3U/ml,实现了B.subtilis α-淀粉酶基因的分泌表达。     

解脂耶氏酵母脂肪酶Lip2的表面展示及其酶学性质

表面展示酶作为全细胞催化剂具备诸如能提高酶的稳定性、省去纯化过程、节约成本等优点。脂肪酶是应用最为广泛的工业酶之一。本研究利用酿酒酵母细胞壁蛋白Cwp2作为锚定蛋白,将解脂耶氏酵母脂肪酶Lip2展示在酿酒酵母细胞表面,以制备脂肪酶全细胞催化剂。Lip2被融合到Cwp2的N端,Cwp2通过其C端的GPI锚定信号共价结合到细胞壁上。表面展示的Lip2可以水解三丁酸甘油酯及对硝基苯酚辛酸酯(pNPC),其pNPC水解酶活达到4.6U/g干细胞。作为全细胞催化剂,表面展示的Lip2具备良好的催化特征,其最适温度为40°C,最适pH为8.0,同时还具备良好的有机溶剂稳定性。     

汉江流域黑竹冲河杂色特维摇蚊和波特真开氏摇蚊的生产量动态及营养基础分析

大型底栖动物在河流生态系统中发挥着重要作用,2003年6月至2004年6月间对汉江流域2级河流--黑竹冲河大型底栖动物群落优势种类的生产力进行为期1周年的调查研究,结果表明,主要优势种杂色特维摇蚊(Tvetenia discoloripes Goetghebuer)和波特真开氏摇蚊(Eukiefferiella potthasti Lehmann)的生活史均为1年1代.杂色特维摇蚊种群现存量在1年中出现1次峰值,波特真开氏摇蚊则出现3次.采用龄期频率法(1nstar-frequency method)测算的周年生产量分别为杂色特维摇蚊,120.3058g/(m2·a),P/B为10.5;波特真开氏摇蚊,17.7554g/(m2·a),P/B为11.4.两种摇蚊的生产量动态在时间上重叠程度较大,比例相似性系数达0.63,重叠现象主要发生在冬春季节.杂色特维摇蚊前肠内含物中,无形态碎屑、真菌和硅藻所占平均比例为95.81%,0.52%和3.67%;对生产量的贡献率分别为87.56%,2.38%和10.06%;波特真开氏摇蚊前肠内含物中,无形态碎屑、真菌和硅藻所占比例分别为93.48%,0.68%和5.84%,对生产量的贡献率分别为81.71%,2.97%和15.32%.     

脂肪酶固定化及其稳定性研究

目的:研究脂肪酶的固定化工艺及其稳定性。方法:以四甲氧基硅烷(TMOS)和甲基三甲氧基硅烷(MTMS)为前驱体的溶胶-凝胶法(sol-gel)固定化黑曲霉属脂肪酶。结果:最优固定化条件是:TMOS 0.5mmol、MTMS 2.5mmol,水与硅烷前驱体摩尔比(R)12,PEG400 120μL,给酶量120mg。酶的固定化效率为93.7%,比活力为游离酶的2.2倍。固定化酶和游离酶在60℃处理2h,其残余酶活分别为91.8%和0;在pH 11的缓冲液中处理2h,其残余酶活分别为95.2%和82%。结论:酶经固定化后其活力、热稳定性和pH稳定性均有提高。     

利用a凝集素在酿酒酵母表面展示解脂耶氏酵母脂肪酶Lip2

[目的]将解脂耶氏酵母胞外脂肪酶Lip2展示在酿酒酵母表面,构建全细胞催化剂.[方法]采用PCR方法扩增得到解脂耶氏酵母胞外脂肪酶Lip2成熟肽编码基因LIP2,将其连接到AGA2基因的下游构建表面展示载体pCTLIP2.分别以橄榄油、三丁酸甘油酯和对硝基苯酚棕榈酸酯(pNPP)为底物检测展示的脂肪酶酶活.在此基础上,对野生菌及工程菌的酶学性质进行比较.[结果]展示Lip2的酿酒酵母重组菌株在半乳糖的诱导下,表现出水解橄榄油、三丁酸甘油脂以及pNPP的活性,20℃诱导72h时酶活达到最高,为182 U/g干细胞.对展示的Lip2的酶学性质研究表明,其最适温度为40℃,最适pH为8.0,温度稳定性比自由酶有所提高,50℃温浴4 h后残余酶活为其最大酶活的23.2%.以不同碳链长度的对硝基苯酚酯为底物检测其底物特异性,结果显示其水解C8,C12,C16对硝基苯酚酯活性相近,均远高于对硝基苯酚丁酸酯(C4)的水解酶活.[结论]对于Lip2,a凝集素系统是一个有效的展示系统,利用该系统成功将Lip2展示在酿酒酵母表面,从而构建了酿酒酵母全细胞催化剂,该全细胞催化剂具有良好的潜在应用前景.     

毕赤酵母中表达透明颤菌血红蛋白提高重组脂肪酶的表达

解脂耶氏酵母胞外脂肪酶Lip2(YlLip2)是一种具有广泛应用前景的工业酶.为了改善高密度发酵生产Y1Lip2过程中的溶氧限制,提高Y1Lip2的表达量,将YlLip2基因lip2和透明颤菌血红蛋白(VHb)基因vgb分别置于AOXl启动子和PsADH2启动子的调控之下,进行YlLip2和VHb在毕赤酵母中的共表达.PsADH2启动子来源于树干毕赤酵母Pichia stipitis,在低氧条件下能被激活.SDS-PAGE和CO-差式光谱分析表明,Y1Lip2和VHb在重组菌中成功实现了共表达.在氧限制性条件下,VHb表达的细胞(VHb+,GS 115/9Klip2-pZPVT)与对照细胞(VHb-,GS 115/9Klip2)相比,摇瓶和10 L发酵罐中YlLip2表达量分别提高了25％和83％.此外,在低氧条件下,VHb+细胞在10 L发酵罐中的生物量也比VHb-细胞高.文中也获得了一株表达了VHb的并携带有多个lip2基因拷贝的克隆子GS 115/9Klip2-pZP VTlip2 49#,在低氧条件下,该克隆子在10L发酵罐中的最高脂肪酶水解活力达33 900 U/mL.因此,在毕赤酵母中用PsADH2启动子表达VHb,同时增加lip2基因的拷贝数是提高YlLip2表达量的一种有效策略.     

藤壶附着机理及其粘胶蛋白的研究进展

海洋固着动物分泌的粘胶蛋白在潮湿环境下可以抵御水的阻力而发挥粘性,成为当今生物医学和仿生学领域开发高性能材料的关键候选材料。藤壶作为海洋污损生物之一,通过分泌的藤壶胶可以在水下牢固地附着在不同表面特性的基底材料上。目前,对藤壶的粘附过程已经有了较为深入的了解,但其水下粘附机制尚未特别清晰,还需进一步阐明。为此,本文对藤壶胶及其粘附过程的研究进展进行了综述,介绍了藤壶胶主要粘胶蛋白的研究进展、总结了藤壶胶蛋白的获取方式及其应用,最后提出了可能的研究要点和未来发展方向。