S基因显性阴性突变体干扰乙肝病毒颗粒组装的研究

目的　探讨S基因突变对HBV病毒颗粒组装的影响。方法　构建野生型S基因、S基因突变的真核表达载体pcDNA3 S和pcDNA3 mS及S基因突变的全长HBV基因组表达载体pHBV mS ,用pHBV mS与pcDNA3 S共转染HepG2细胞 ,pHBV mS与pcDNA3共转染HepG2细胞 ,以adwR9与pcDNA3共转染为对照 ;pcDNA3 mS和adwR9共转染HepG2细胞 ,以adwR9和pcDNA3共转染为对照 ,用荧光定量PCR检测胞内和上清中病毒量 ,用ELISA方法检测上清中S抗原。结果　pHBV mS与pcDNA3共转染组上清中病毒量较对照组低而胞内病毒量二者相同。pHBV mS与pcDNA3 S共转染组上清、胞内病毒量与对照组相同。pcDNA3 mS和adwR9共转染HepG2细胞其上清中病毒量较对照组低而胞内病毒量两者相同。上清中S抗原实验组较对照组低。结论　S突变体干扰HBV病毒颗粒的组装 ,导致的HBV病毒颗粒分泌下降。     

基因重组HBV联合表达反义RNA和显性阴性突变体抗HBV作用及HBV包装细胞系的构建

目的探讨HBV作为基因治疗载体的可能性并检验其联合表达反义RNA和显性阴性突变体抗HBV的作用.方法在表达完整HBV颗粒的质粒上,经基因修饰后联合表达S区反义RNA和核心-p蛋白的融合蛋白,整合于具有HBV复制的2.2.15细胞,形成细胞克隆,ELISA法检测细胞培养上清液中HBsAg和HBeAg,斑点杂交法检测细胞内HBV核壳中HBV DNA,PCR检测上清液中重组HBV颗粒.HBV全基因经删除包装信号ε区后,插入到G418抗性pCI-neo载体,转染HepG2细胞系,用G418筛选形成细胞克隆,检测表达HBsAg及HBcAg较多者作为HBV包装细胞系,进一步转染表达复制缺损型HBV的质粒,经两种抗生素同时筛选,PCR方法观察上清液中的病毒.结果2.2.15-pMEP4组、2.2.15-CP组、2.2.15-SAS组和2.2.15-CPAS组,对HBsAg平均抑制率分别为2.74%±3.83%、40.08%±2.05%(t=35.5,P＜0.01)、66.54%±4.45%(t=42.3,P＜0.01)和73.68%±5.07%(t=51.9,P＜0.01);对HBeAg平均抑制率分别为4.46%±4.25%、52.86%±1.32%(t=36.2,P＜0.01)、26.36%±1.69%(t=22.3,P＜0.01)和59.28%±2.10%(t=39.0,P＜0.01);对HBV复制的抑制率分别为0、82.0%、59.9%和96.6%.在各治疗组培养上清液中均能检测出重组HBV颗粒.证明包装细胞系具有HBsAg和HBcAg表达,pMEP-CPAS质粒转染G418抗性包装细胞系,在细胞培养上清液中检出重组HBV,未检出野生型HBV.结论在同一载体上联合表达S区反义RNA及核心蛋白与部分P蛋白的融合蛋白,具有较单一机制更强的抗HBV作用;经修饰后的HBV基因组在野生型HBV辅助下,仍能包装并分泌完整的HBV样颗粒.包装细胞系能为复制缺损型HBV提供包装,但效率较低.     

丙型肝炎患者外周血单核细胞内病毒载量与干扰素治疗效果的相关性研究

目的 探讨慢性丙型肝炎患者外周血单核细胞(PBMCs)中病毒载量,观察聚乙二醇干扰素(PEG-IFNa-2a)抗病毒治疗后PBMCs中HCVRNA的变化及其临床意义.方法 采用荧光定量方法检测丙型肝炎患者血清及外周血单核细胞内病毒载量.结果 血清中HCVRNA阳性患者其PBMCs中检出率为83.6%,HCV RNA阴性患者检出率为16.3%;治疗结束及停药6个月时丙氨酸氨基转移酶(ALT)复常率、PBMCs中HCVRNA阴转率均与治疗前比较下降明显(P<0.05),PEG-IFNa-2a对血清及PBMCs中的HCVRNA均有明显的抑制作用,但PBMCs中HCVRNA清除速率较血清明显延迟.结论 PBMCs是HCV在肝外复制的重要场所,是评价HCV活动最理想的标志,可作为临床评价病毒复制程度和抗病毒疗效的参考指标.     

实时荧光定量聚合酶链反应技术检测乙型肝炎病毒YMDD变异的临床应用及意义

目的检测慢性乙型肝炎（CHB）患者在使用拉米夫定过程中，乙型肝炎病毒YMDD变异的发生情况并分析与YMDD变异发生的相关因素。方法110例慢性乙肝患者作为拉米夫定治疗组，30例CHB患者作为对照组。采用实时荧光PCR方法分别检测两组患者在用药期间HBV-YMDD变异的发生情况，同时检测治疗组在用药前后的HBV-DNA水平。结果治疗组在48周时的变异率为22．7％，明显高于对照组3．3％及24周时的变异率3．6％（P均〈0．05）；治疗前HBV-DNA水平较高组（47例）患者用药48周时的变异率（31．9％）明显高于HBV—DNA水平较低组（29例）患者的变异率（10．3％）（P〈0．05）；治疗组中未变异的85例患者在48周时的HBV—DNA阴转率（74．1％）明显高于变异的25例患者HBV—DNA阴转率（16．0％）（P〈0．05）。结论拉米夫定可导致HBV-YMDD变异的产生，且变异的发生率随着用药时间的延长而增加；HBV-YMDD变异的发生同HBV—DNA水平关系密切。