日本血吸虫中国大陆株22.6kD膜相关蛋白基因的克隆及其在大肠杆菌中的高效表达*

以日本血吸虫mRNA为模板,用RTPCR法快速克隆到一大小约600bp的DNA片段,DNA序列分析证实,所扩增到的DNA片段中含有日本血吸虫22.6膜相关蛋白(Sj22.6(Ch))基因,将该基因重组到表达型质粒pGEX-4T中,表达的GST融合蛋白分子量约48kD,用谷胱甘肽琼脂糖凝胶亲和层析柱纯化的重组蛋白不仅纯度好,而且得率高,纯化产量可达40mg/L培养物,免疫试验结果表明该重组蛋白具有良好的抗原性,为其在血吸虫病抗感染中的免疫作用研究创造了条件。     

甲醇酵母Pichia pastoris高水平表达有活性的辣根过氧化物酶

表达有活性的辣根过氧化物酶(HRP)不仅可以深入揭示HRP结构与功能及其生理作用规律,而且为HRP的广泛需要提供新的来源.为了在甲醇酵母P.pastoris中成功表达,将编码HRP-C成熟肽的cDNA构建到pPIC9上,再转化到P.pastoris中,筛选到了分泌表达非糖基化HRP和高糖基化HRP(分子质量超过100 ku)两种主要产物的重组细胞株.优化表达条件,目标产物在摇瓶发酵液中高效表达,可达4～6 g/L.并且直接从发酵液中可获得具有活性的高糖基化HRP,每毫升发酵液中酶活力约有2 U,经初步的纯化HRP具有最大吸收峰403 nm.     

茶尺蠖核型多角体病毒多角体蛋白基因核苷酸序列及其在Baculoviridae中的地位(英文)

茶尺蠖核型多角体病毒（ＥｏＳＮＰＶ）基因组的ｐｏｌｈ和ｅｇｔ基因区约１４．２ｋｂ的酶切图谱被构建．ｅｇｔ基因位于ｐｏｌｈ基因上游约４．８ｋｂ处,但转录方向与ｐｏｌｈ基因相反．ＥｃｏＲⅤ－Ｌ片段ｐｏｌｈ基因及其旁侧的１１２５核苷酸序列被测定．ｐｏｌｈ基因编码区长７３８核苷酸,可编码２４６氨基酸的多肽．起始密码子ＡＴＧ上游是一个富含ＡＴ（ＡＴ占７１．２％）的启动子区,在－５２核苷酸处有杆状病毒晚期基因启动子转录起始基序ＡＴＡＡＧ．在终止密码子下游２０８核苷酸有一个ｐｏｌｙ（Ａ）信号,ＡＡＴＡＡＡ．但ＥｏＳＮＰＶｐｏｌｈ基因起始密码子ＡＴＧ相邻核苷酸序列为ＧＴＡＡＴＧＴ,其－３是个Ｇ,这与已知的１６种其它杆状病毒ｐｏｌｈ基因－３位置均是Ａ不相同．在分析了ＥｏＳＮＰＶ和ＨａＳＮＰＶ多角体蛋白基因核苷酸序列的基础上,通过ＭＡＬＩＧＮ程序,比较了目前已发表的２６种杆状病毒包涵体蛋白的序列,ＥｏＳＮＰＶ与黄杉毒蛾核型多角体病毒（ＯｐＳＮＰＶ）的同源性为最高,核苷酸序列的同源性为８３．０％,氨基酸序列达９４．７％;与其它２０种鳞翅目ＮＰＶ的同源性也很高,核苷酸序列同源性为７２．６％～８１．９％,氨基酸序列为８３．７％～９３     

辣根过氧化物酶同功酶C基因克隆及其在大肠杆菌中的表达

无论从应用还是从理论研究角度,辣根过氧化物酶（ＨＲＰ）是一种非常重要的酶．ＨＲＰ基因克隆与表达将有利于更深入研究ＨＲＰ的结构与功能．利用反转录ＰＣＲ从天然植物辣根中分离和克隆编码辣根过氧化物酶同功酶Ｃ（ＨＲＰ－Ｃ）一个ｃＤＮＡ,并测定其序列．结果发现,从基因推导出的氨基酸序列与Ｗｅｌｉｎｄｅｒ报道的辣根过氧化物酶序列有９０．６％的同源性．将该基因连接到表达载体ｐＥＴ－２４ｂ上,利用抗ＨＲＰ多克隆抗体进行Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ,检测有少量目标产物表达．在诱导表达过程中,没有发现细菌生长受抑制或受明显的毒害     

氯霉素乙酰基转移酶基因在家蚕核型多角体病毒P10基因启动子控制下的表达

昆虫核型多角体病毒(NPV)P10基因属于晚期基因,为强启动子所控制,又是病毒复制所非必需的基因。我们对前报的家蚕核型多角体病毒(BmNPV)P10基因,应用PCR技术进行ATG区定点突变,在ATG被突变的同时形成一个BglⅡ酶切位点,得到一个不含ATG的BmNPV P10基因启动子。将长为230bp的经突变后的BmNPV P10基因5’端(包括启动子所有特征)片段克隆进pMMTV·CAT质粒中,构建成一个CAT基因在BmNPV P10基因启动子控制下的pBmPl0·CAT瞬间表达质粒。该质粒通过转染进入经野生型BmNPV感染的BmN细胞中,CAT得以表达。证明BmNPV P10启动子是比较强的启动子,可以在BmN细胞表达外源基因,具备了作为表达载体启动子的特性。     

巨大芽孢杆菌的青霉素酰化酶基因在大肠杆菌中的克隆和表达(英文)

从巨大芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｕｓｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）ＣＡ４０９８的基因组中,通过ＰＣＲ方法扩增青霉素酰化酶（ｐｇａ）基因,克隆到ｐＫＫ２２３－３质粒中,在Ｅ．ｃｏｌｉＨＢ１０１中得到表达。同时,测定了ｐｇａ基因的全部序列,推出氨基酸序列,再与不同菌种来源的青霉素酰化酶的氨基酸序列进行比较,表明它们的序列有一定的保守性,尤其是活性部位的保守性更强。     

以牛痘病毒为载体的乙型肝炎病毒表面抗原基因的表达

乙型肝炎是一种严重危害人类健康的疾病,对它的防治国内外均十分重视。乙型肝炎是由乙型肝炎病毒(HBV)感染所致。HBV是部分单链的DNA病毒,其基因组编码了表面抗原蛋白、核心抗原蛋白以及内源DNA聚合酶等蛋白质。乙肝表面抗原蛋白(HBsAg)是病毒的外壳蛋白,在乙肝病人的血液中能形成直径约22nm的表面抗原颗粒。用它作为抗原给动物注射,可使动物产生专一性抗体。     

家蚕核型多角体病毒遍在蛋白及结合肽的研究

从家蚕核型多角体病毒镇江株(Bombyx mori nuclear polyhedrosis virus Zhenjiang strain, BmNPV-ZJ)基因组DNA中克隆遍在蛋白（BmVUB）基因.序列分析结果显示,BmVUB基因长234 bp,编码77个氨基酸.BmVUB氨基酸序列内有一致HTH序列,遍在蛋白保守序列LRLRGG,参与遍在蛋白-蛋白酶复合体形成的4个保守性功能位点(Lys-29、Cys-48、Cys-63、Gly-76)及保守的Gly-Gly-X（X是疏水氨基酸残基）蛋白酶切信号序列,在遍在蛋白保守的Gly-Gly后多出由一个氨基酸组成的延伸肽.原核诱导表达表明BmVUB主要以可溶性形式存在,表达量占总菌蛋白的50%以上.纯化的遍在蛋白浓度为1.03～2.46 g/L,制备抗体,效价在3.2×10^-5以上.用噬菌体表面展示技术筛选遍在蛋白结合肽,所筛选的结合肽可与遍在蛋白特异性结合,其中结合肽VAPHHAYAPMRT对细胞增殖有明显的浓度调控作用,即低浓度促进细胞生长,高浓度强烈抑制细胞的生长.     

核糖核酸酶抑制蛋白变体RIv在大肠杆菌和家蚕细胞中的表达

人源的核糖核酸酶抑制蛋白 (ribonucleaseinhibitor,RI)是一种富含亮氨酸和半胱氨酸残基的酸性蛋白质 ,分子量为 5 0kD。从人胚胎肝cDNA文库中克隆到一个核糖核酸酶抑制蛋白RI基因的变体 (ribonucleaseinhibitorvari ant,RIv)。序列分析表明 ,与RI相比较 ,RIv序列中仅有Arg359Ala和Leu36 5Pro两个氨基酸突变 ,而核苷酸同源性较低 ,为 78%。将RIv克隆于pET2 8a( ) ,并转化大肠杆菌BL2 1(DE3) ,IPTG诱导表达 ,利用 6×His亲和层析柱纯化得到了His RIv重组蛋白。将RIv克隆于转移载体pBacPAK8,利用家蚕核型多角体病毒 (BmNPV)表达系统表达得到重组RIv。体外活性测定实验表明 ,重组RIv具有抑制牛胰RNaseA酶解 2 8S和 18SrRNA的作用。     

人干扰素α 2b-胸腺肽α 1融合基因在家蚕细胞中的表达和活性研究

根据细胞因子协同作用的特点,采用重组DNA技术构建了人干扰素(IFN)α2b-胸腺肽(THY)α1融合基因,克隆到pBacPAK8上,获得重组转移载体pBacPAK-IFN-THY.与线形化Bm-BacPAK6病毒基因组DNA共转染家蚕细胞,经过体内重组,筛选到重组病毒Bm-BacPAK-IFN-THY.将Bm-BacPAK-IFN-THY感染家蚕细胞进行表达.DNA印迹证明IFN-THY已插入Bm-BacPAK6中（4 kb左右的杂交带）;SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、蛋白质印迹证明IFN-THY在家蚕细胞中得到了表达（分子质量为23 ku左右）,且具有IFN蛋白的免疫原性;微量细胞病变抑制法和玫瑰花结法显示96 h的表达产物IFN活性为3.72×10⁴ U/ml,120 h表达产物IFN活性为3.10×10⁵ U/ml,48～72 h表达产物IFN活性较低;48～120 h表达产物的玫瑰花结形成率均在10％以上.结果表明融合基因在家蚕细胞中得到了高效表达,表达的融合蛋白具有IFN-α2b和THY-α1的双重生物活性.