可直接克隆PCR产物的毕赤酵母分泌型表达载体

从毕赤酵母表达载体pPICZαA出发,构建了可直接克隆PCR产物的毕赤酵母分泌型表达载体（毕赤酵母表达型T载体）。设计合适的引物扩增一DNA片段,使该片断的上游含XhoⅠ和Eam1105Ⅰ酶切位点,下游含Eam1105Ⅰ和XbaⅠ酶切位点。通过XhoⅠ和XbaⅠ位点将扩增产物与质粒pPICZαA连接形成重组质粒。用Eam1105Ⅰ酶切重组质粒,回收大片段即得到毕赤酵母表达型T载体pPICZαT。使用该表达型T载体进行了里氏木霉纤维二糖水解酶Ⅱ基因（cbh2）的克隆和在巴氏毕赤酵母中的表达。结果表明,使用表达型T载体可以直接克隆PCR产物,而且可以使外源基因在毕赤酵母中成功表达。另一方面,使用该载体时不需要使用限制性内切酶,从而可以避免在所表达蛋白的N-末端引入多余的氨基酸。     

血红蛋白基因在产CBHⅡ毕赤酵母工程菌中的表达

目的:提高毕赤酵母工程菌P.pastoris-CBHⅡ液体发酵产纤维二糖水解酶(CBHⅡ)的能力。方法:分别构建了用于胞外及胞内表达透明颤菌血红蛋白(VHb)基因的毕赤酵母重组表达质粒pPICZαA-vhb与pPICZαA(-s)-vhb。通过电转化将两种质粒转化巴氏毕赤酵母重组菌体P.pastoris-CBHⅡ菌株,经过筛选分别获得可正确表达具有生物活性的VHb蛋白的重组菌株P.pastoris-CBHⅡ-vhb(胞内表达VHb)及P.pastoris-CBHⅡ-vhb(-s)(胞外表达VHb)。结果:摇瓶发酵实验表明,血红蛋白在贫氧条件下可促进CBHⅡ的分泌表达,培养液上清的CMC酶活分别从出发菌株P.pastoris-CBHⅡ的1.81U/ml提高到2.04U/ml(胞内表达VHb)与1.93U/ml(胞外表达VHb)。VHb蛋白胞内表达菌株比胞外表达菌株效果更明显。     

关于蚕豆根端分生组织细胞核中类胀泡结构的研究

本文对蚕豆根端分生组织细胞核中类胀泡结构的超微结构变化和细胞化学特点进行了研究。我们观察到,类胀泡结构是与集缩染色质紧密相连的核内结构。该结构是由直径30nm左右的纤维组成的较为疏松的网络,其中的30nm纤维可以进一步解集缩并释放出直径约10nm的颗粒,这些颗粒可能是核小体。Bernhard染色结果表明,类胀泡结构含有RNP。放射自显影结果表明,类胀泡结构具有转录活性。我们推测,蚕豆细胞核中的类胀泡结构可能是非核仁基因表达的一种形态。     

BrUTP标记的小麦核仁中RPⅠ转录位点

核仁是细胞核中最明显的结构之一,是绝大多数真核细胞中基因转录最为活跃的区域,包括纤维中心（ｆｉｂｒｉｌａｒｃｅｎｔｅｒ,ＦＣ）、致密纤维组分（ｄｅｎｓｅｆｉｂｒｉｌｌａｒｃｏｍｐｏｎｅｎｔ,ＤＦＣ）、颗粒组分（ｇｒａｎｕｌａｒｃｏｍｐｏｎｅｎｔ,Ｇ...     

ScII类似蛋白是洋葱根端细胞核、染色体和染色体骨架的组成成分

采用机械破碎和蔗糖梯度离心方法从洋葱根端分生组织中分离出细胞核并制备出核骨架。细胞核SDS-PAGE谱带中135kD处有一多肽,免疫印迹实验结果表明,该多肽可被抗鸡ScⅡ抗体标记,核骨架中没有此多肽。经抗ScⅡ抗体和FITC偶联的二抗标记后,细胞核发出代表ScⅡ的特异性荧光,而核骨架中无荧光发出。经抗ScⅡ抗体和蛋白A胶体金处理后,金颗粒特异性地结合在核内染色质区域。说明ScⅡ类似蛋白是洋葱根端细胞核的组分,且位于核内染色质上,但该蛋白不是核骨架成分。免疫荧光和免疫电镜实验结果还说明ScⅡ类似蛋白是洋葱根端细胞染色体和染色体骨架的组成成分。     

蚕豆细胞核仁和核质中剪接因子SC35的定位研究

本文以蚕豆(Vicia faba L.)根端分生组织细胞为材料,以抗SC35抗体为探针,在电镜下对SC35在高等植物细胞中的存在与否和分布特点进行了研究,发现经抗SC35抗体标记后,标明SC35位置的胶体金颗粒主要分布于核仁的致密纤维组分(DFC)、核质的染色质间颗粒(IGs)和染色质周边纤维处(PFs),而核仁的纤维中心(FC)、核仁液泡和集缩染色质团块中央部位的金颗粒很少。DFC, IGs和PFs处的金颗粒平均密度分别为65.89个/μm~2和36.28个/μm~2,远远高于集缩染色质团块中央部位以及FC和核仁液泡处的金颗粒平均密度(分别为5.90个/μm~2和6.26个/μm~2)。说明蚕豆细胞核仁的DFC,核质的IGs和PFs处富含剪接因子SC35。本文研究结果表明,SC35或SC35类蛋白在蚕豆细胞核质中的分布与其在哺乳动物细胞核质中的分布规律相似。同时本文首次报道了SC35或SC35类蛋白存在于核仁中。     

洋葱根端分生组织细胞核中RNA多聚酶Ⅱ转录位置的研究

采用溴尿嘧啶核苷三磷酸(BrUTP)标记技术,对洋葱(Allium cepa L.)根端分生组织细胞核中RP Ⅱ转录位置进行了研究。经BrUTP和抗BrdU抗体标记后,在电镜下观察到染色质区域周边部位存在大量的金颗粒,该区域金颗粒数目占细胞核内非核仁区域金颗粒总数的92.70%,金颗粒密度为75.42个/μm~2,明显高于染色质问区域和染色质区域中央部位的金颗粒数目的百分比(分别为1.93%和5.37%)和金颗粒密度(分别为2.00个/μm~2和5.89个/μm~2),说明在染色质区域周边部位进行着旺盛的RPⅡ转录位置。经α-鹅膏蕈碱(10μg/L,2h)处理后,非核仁区域金颗粒的减少极其显著,其金颗粒密度从44.60个/μm~2降至2.67个/μm~2,进一步确认该区域中的金颗粒代表RPⅡ转录产物。讨论了完整植物细胞核内RPⅡ转录位置的分布。     

紫鸭跖草花粉母细胞减数分裂细胞核和染色体含有F—肌动蛋白

肌动蛋白间接免疫荧光标记实验观察到紫鸭跖草花粉母细胞减数分裂前期Ⅰ细胞核,中期┘染色体,二分体和四分体均发现较明亮的黄绿色荧光,说明其中含有肌动蛋白。经ＴＲＩＴ－Ｃ鬼等环肽荧光标记后,减数分裂前Ⅰ细胞核,二分枝及中期Ⅰ染色体均发现较明亮的红色荧光;ＣＤ处理后细胞核和染色体的荧光明显减弱或没有荧光,说明其中存在Ｆ－肌动蛋白。