VEGF基因转染血管内皮祖细胞的实验研究

目的:探讨血管内皮生长因子（VEGF）基因转染血管内皮祖细胞（EPCs）的方法及效果。方法:取生长活跃的EPCs，分别转染不同浓度的携带VEGF-165基因的腺病毒质粒（Adv-GFP-VEGF165）（转染组）及空质粒（Adv-GFP）（空质粒组），并设空白对照组。荧光显微镜下观察转染效果，MTT法检测不同病毒滴度时细胞增殖情况；ABC-ELISA法检测上清液中VEGF蛋白表达情况。结果:转染组镜下观察到大部分细胞呈现绿色荧光。病毒滴度为1∶100的转染会导致细胞生长停滞，并造成细胞损害； 1∶50的转染后对细胞增殖无明显影响。ELISA检测证实转染组上清液中VEGF蛋白浓度明显高于空质粒组及空白对照组（P<0.01）。结论:以腺病毒为载体的VEGF基因转染EPCs是可行的，1∶0是合适的转染比率，转染后上清液中VEGF蛋白表达明显增加。     

血管内皮祖细胞与调控性细胞因子

血管内皮祖细胞是一群起源于骨髓，具有与来源于胚胎血岛细胞有着相似特征的单核细胞群，作为内皮细胞的前体细胞，是血管组织工程的良好种子细胞。研究对内皮祖细胞的动员、增殖和分化有着调控作用的多种细胞因子（如GM-CSF、G-CSF、VEGF、EPO等），对揭示生理和病理状态下血管新生和修复的机制有着重要意义。本文就内皮祖细胞与对其有着调控作用的细胞因子的关系作一综述。     

双阴性选择法纯化培养人骨髓多能成体祖细胞

OBJECTIVE: To establish a method for purifying and culturing human multipotent adult progenitor cells (MAPCs) in vitro. METHODS: Mononuclear cells were separated from the bone marrow of healthy adult volunteers by density gradient centrifugation and cultivated in adherent culture. The plastic-adherent cultured bone marrow cells were isolated by magnetic-activated cell sorting with CD45 and GlyA magnetic microbeads, and the purity of CD45-/GlyA- cells evaluated by flow cytometry. Phase-contrast microscopy was used to detect morphological changes of the cells in different stages of culture. RESULTS: Approximately (5-10)x10(4)/ml MAPCs could be separated from every 1x10(6)/ml bone marrow mononuclear cells by magnetic- activated cell sorting. The viability of the cells before and after separation was (96.7+/-1.7)% and (96.0+/-2.4)%, respectively. The isolated MAPCs grew well in a self-prepared culture medium till the16th passage. The purity of CD45-/GlyA- separated from the bone marrow was more than 98% as examined by flow cytomety even till the 12th passage. CONCLUSIONS: MAPCs derived from adult human bone marrow can be purified by magnetic-activated cell sorting with CD45 and GlyA microbeads and retain the undifferentiated state for a long time. The self-prepared culture medium is appropriate for MAPCs cultures in vitro.     

人外周血内皮祖细胞移植促裸鼠缺血组织血管新生的初步研究

目的观察人外周血内皮祖细胞移植对下肢缺血裸鼠血管新生的影响。方法从人自愿者外周血中分离单个核细胞 ,置于EBM -2培养基内培养7d后 ,获得内皮祖细胞。将1×106个内皮祖细胞通过尾静脉注入下肢缺血裸鼠体内 (8只 ) ,对照组 (8只 )通过尾静脉注入等量的PBS。移植后第28d ,处死动物 ,进行组织学和生理学评估。结果内皮祖细胞组毛细血管密度较对照组明显增加[(136.4±40.5)/视野 ,(53.65±14.02)/视野 (P<0.01)] ;内皮祖细胞组的肢体致残率 (25 % )较对照组 (50 % )减少。结论体外扩增的内皮祖细胞移植能够促进缺血组织的血管新生 ,并能减少肢体的致残率。     

人胎盘CD133+细胞具有高增殖潜能集落形成细胞特性

目的 通过对人胎盘CD133⁺细胞群中高增殖潜能集落形成细胞(HPP-CFC)检测与生物学特性的分析，证明人胎盘存在早期造血干/祖细胞（HSPC）。 方法 采用机械法制备人胎盘组织（PT）单细胞悬液，用Histopaque-1007分离出单个核细胞(MNC)，经磁式分选（MACS）富集CD133⁺细胞，培养28 d后观察HPP-CFC集落形成能力，用流式细胞仪（FCM）对分选的细胞组份和HPP-CFC进行表型分析，实验全程用脐带血（UCB）作平行比较分析。 结果 培养28 d后，PT-CD133⁺与UCB-CD133⁺细胞组份分别扩增了266和362倍，前者低于后者（P<0.01）；PT-CD133⁺与UCB-CD133⁺细胞中HPP-CFC分别为(32.4±11.2)/5×10³、(17. 7±5.7)/5×10³，前者形成的HPP-CFC数量明显高于后者（P<0.01）；PT-CD133⁺、UCB-CD133⁺细胞培养至28 d时，除UCB-CD133⁺组的CD133⁺CD34^-亚群比例无明显改变外，CD133⁺CD34⁺、CD133^-CD34⁺和CD133⁺CD34^-（PT-CD133⁺组）亚型均比培养前减少。 结论 人胎盘组织CD133⁺细胞中存在HPP-CFC，说明胎盘CD133⁺细胞群中存在早期HSPC。     

三七总皂甙对红系祖细胞增殖调控机理的研究

采用造血祖细胞体外培养和造血生长因子检测等实验血液学技术，研究三七总皂甙对小鼠红系祖细胞调控的生物学机理。结果表明：三七总皂甙对正常或骨髓抑制一贫血模型小鼠的红系祖细胞增殖有明显促进作用。三七总皂甙亦可提高阿糖胞苷所致祖细胞的“自杀”率；经三七总皂甙诱导制备的脾细胞，Ｌ细胞培养上清液和红系祖细胞的直殖具有较高刺激活性。     

重组人白细胞介素2对骨髓造血祖细胞体外增殖的影响

重组人白细胞介素２对骨髓造血祖细胞体外增殖的影响郝思国邹正辉①杨吉成②虞斐①盛伟华②王苏③沈美凤①（安徽医科大学附一院，合肥２３００２２）①苏州医学院附二院，苏州２１５００４②苏州医学院，苏州２１５００７③辽宁省人民医院血液科，沈阳１１０００３作者简...     

成年大鼠去皮层血管引起前脑室下区祖细胞增殖迁移并形成迁移路至损伤部位(一)祖细胞增殖迁移的部位在背外侧脑室下区

成年哺乳动物脑室下区(SVZ)富有神经干细胞、神经细胞祖细胞和胶质细胞祖细胞,它们能生成新的神经细胞、星状胶质细胞和少突胶质细胞。SVZ中的神经细胞祖细胞能形成切线形式的嘴侧迁移流(RMS)到嗅球,在嗅球分化成成熟的中间神经元。近年来证明成年动物实验性脑损伤和变性疾病都能引起SVZ细胞增生并能向非嗅球区迁移。本研究将成年大鼠一侧大脑皮层血管去除,15d和30d后取前脑作冠状及矢状连续切片,用BrdU和PCNA抗体显示前脑室下区正在分裂的细胞;用Tuj1抗体显示神经元祖细胞;用GFAP和vimentin抗体显示胶质细胞祖细胞。结果证明去除一侧皮层血管引起术侧及其对侧的背外侧脑室下区(dl-SVZ)的上述免疫反应阳性细胞明显增多,并向胼胝体迁移,在胼胝体内形成放射形式迁移路至损伤部位。本研究表明背外侧脑室下区的范围应包括背外侧角、外侧伸展和侧脑室上壁的SVZ,它们是切线形式和放射形式两种不同方向的迁移路祖细胞的共同源地。     

血管内皮祖细胞的体外扩增特性研究

目的:探讨血管内皮祖细胞(EPCs)在体外扩增特性。方法:利用磁性活化细胞分选系统(MACS)系统富集CD34⁺细胞,在相同条件下与同批的单个核细胞(MNC)、CD34⁺和CD34^-混和细胞进行对照培养,比较EPCs体外扩增效果。另外研究血管内皮生长因子(VEGF)和传代培养对细胞分化、扩增动力学和细胞凋亡的影响。应用细胞免疫化学和流式细胞术对细胞定性定量分析。结果:MNC培养、CD34⁺和CD34^-细胞混和培养明显高于CD34⁺细胞单独培养EPCs扩增率(P＜0.05),一旦细胞形成线索样结构行传代培养明显低于未传代的细胞凋亡(P＜0.05)。VEGF对细胞凋亡(P＞0.05)无明显影响,这些分化的EPCs免疫细胞化学染色CD34、vWF、KDR、CD31阳性,并且吞噬乙酰化低密度脂蛋白(Ac-LDL)。培养7d流式细胞检查CD34⁺、AC133^＋分别占贴壁(AT)细胞的68.2%±6.3%(n=6)、57.2%±9.8%(n=6)。结论:MNC培养、CD34⁺和CD34^-细胞混和培养提高了EPCs扩增率,早传代使凋亡率明显降低。VEGF对EPCs体外扩增无明显影响。     

血管内皮生长因子对外周血内皮祖细胞功能的影响

目的: 观察不同浓度血管内皮生长因子(VEGF）对体外培养人外周血内皮祖细胞（EPCs）生物学功能的影响，探讨VEGF促进EPCs分裂生长的合适浓度。方法: 密度梯度离心法获取人外周血单个核细胞（MNCs），接种至人纤维连接蛋白（HFN）包被的培养板上，培养4 d后收集贴壁细胞，换用配有不同浓度（对照组、10 μg/L、20 μg/L、50 μg/L）VEGF的培养基继续培养3 d后进行细胞免疫组化鉴定EPCs，采用MTT比色法、改良的Boyden小室和黏附能力测定实验，观察EPCs的增殖、迁移和黏附能力。结果: 从人外周血能成功分离EPCs细胞，并能分化为血管内皮细胞；从冠心病患者分离的EPCs增殖能力较非冠心病患者弱；VEGF在较低浓度（10 μg/L和20 μg/L）时即能显著促进EPCs生长的各项生物学指标，但高浓度（50 μg/L）时并不能进一步增强这一效应；低浓度（10 μg/L）下VEGF对冠心病患者作用较非冠心病患者弱，高浓度时对两者促进作用相近。结论: 冠心病患者EPCs功能显著减弱，较低浓度的VEGF即可显著增强EPCs的各项生物学功能，可能对损伤血管的再内皮化有益。