基于转录组分析筛选凡纳滨对虾低温胁迫下的差异表达基因

凡纳滨对虾(Litopenaeusvannamei)是中国主要的对虾养殖品种之一,对低温的耐受性较差,低于18℃就会停止摄食。为了探究凡纳滨对虾耐低温性状相关基因,选用凡纳滨对虾低温胁迫组(18℃)和常温组(24℃)肝胰腺组织为实验材料,进行Illumina HiSeq 2500测序,对测序原始数据进行拼接、注释,以及筛选分析低温胁迫下的差异表达基因。结果显示,测序共获得50921条基因(unigene),平均长度为828 bp, N50为1589 bp,其中28.13%为已知基因。基因差异表达分析共筛选得到243个低温胁迫相关基因,其中89个上调表达, 154个下调表达。功能富集分析发现,差异表达基因多富集在生物结合和催化过程、过氧化物酶、溶酶体、精氨酸和脯氨酸的代谢以及氨基酸的生物合成途径中。进一步根据Q-值共筛选出10个差异表达最显著的基因,其中ATP结合盒B亚家族6转运蛋白基因(ATP-binding cassette sub-family B member 6, ABCB6)、C型凝集素基因(C type lectin)、谷氨酰胺合成酶基因(glutamine synthetase, GS)在低温胁迫下均呈下调表达,推测可能参与了凡纳滨对虾低温应答反应。利用Real time RT-PCR验证转录组数据,结果证明基于转录组测序筛选低温胁迫下的差异表达基因是可行的。本研究为揭示凡纳滨对虾耐低温分子调控机制提供了基础数据和理论依据。     

罗氏沼虾开放和闭锁核心育种群生长和存活性能分析

开放核心育种体系可增加核心群体的选择强度,进而增加育种目标性状的遗传进展。本研究以罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii)为研究对象,向闭锁核心群(closed nucleus population,NP)内引入扩繁群(multiplier population, MP)个体,构建两个杂交群体(正交群体NP/MP,反交群体MP/NP),并以闭锁核心群(NP/NP)为对照,应用线性混合效应模型(linear mixed effects model, LME)和广义线性混合模型(generalized linear mixed model, GLMM)对不同群体收获体重和存活率的估计边际均值进行比较,评估在虾类选择育种中构建开放核心育种体系的可行性。结果显示:(1) NP/NP、MP/NP和NP/MP群体的收获体重估计边际均值分别为45.83 g、49.57 g和46.62 g;与NP/NP群体相比, MP/NP和NP/MP群体分别提高了8.16%和1.72%。(2) NP/NP、MP/NP和NP/MP群体的存活率估计边际均值分别为72.92%、68.04%和66.55%;与NP/NP群体相比,MP/NP和NP/MP群体分别降低了6.69%和8.74%。综上所述,在罗氏沼虾核心群中引入扩繁群个体,构建开放核心育种群体,可以有效地增加收获体重的遗传进展;同时在制定选择指数时,应加大存活性状的权重,选择生长和存活性能均优良的家系生产扩繁群体,导入闭锁核心育种群,构建生长和存活性能均优良的开放核心育种群。     

通过精液移植构建中国明对虾家系及微卫星分型鉴定父本

本研究首次采用精液移植法进行中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)的家系构建,利用10尾已交尾雌虾纳精囊内精液对17尾未交尾雌虾进行了移植,共建立11个中国明对虾家系,其中含有父系半同胞家系2个;精液移植的平均受精率为46.8%,最高受精率为78%,授精成功率为64.7%。为了揭示每个家系母本内精液的来源情况,选用6个中国明对虾微卫星标记对11个家系的母本、母本内精液及每个家系的6个个体进行分析,推算出每个家系各自的父本基因型,并与各自母本内精液基因型进行比较,成功地对11个家系进行了父本鉴定。实验结果表明,11个家系的父本基因型与各自母本内精液基因型相同,每个家系内个体属全同胞关系,即对于1尾自然交尾雌虾,其纳精囊内精液只来自于1尾雄虾。通过本实验,验证了精液移植在构建中国明对虾全同胞家系和半同胞家系中的可行性,阐明了精液移植家系内个体的亲缘关系,为中国明对虾选育工作提供了技术保证。     

聚β-羟基丁酸酯对中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)非特异性免疫相关酶的影响

本研究以中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)为对象,探讨不同浓度的聚β-羟基丁酸酯(Poly-β-hydroxybutyrate,PHB)对其非特异性免疫相关酶的影响.实验采用单因子浓度梯度法,对健康的中国明对虾投喂添加不同浓度PHB(0、0.5％、1.0％、2.5％、5.0％、10.0％)的饲料,分别对应对照组C和实验组E0.5、E1.0、E2.5、E5.0、E10.0组,饲喂6周,统计每组中国明对虾的死亡率和相对免疫保护率,检测总抗氧化能力(T-AOC)、酸性磷酸酶(ACP)、过氧化物酶(POD)和过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)5种酶的活力及丙二醛(MDA)含量与时间、PHB浓度的变化关系.结果显示,实验组的相对免疫保护率随PHB浓度的增加呈现先上升后下降的趋势.E1.0组为最高值,并且与其他各组相比差异显著(P＜0.05).随PHB浓度的增加,免疫酶活力整体变化趋势为先上升后下降.在时间分布上,饲喂2-3周时,酶活力呈现高水平表达,其中,T-AOC在血清(E1.0、E2.5组)、肝胰腺(E1.0组);ACP在血清(E1.0、E2.5组)、肝胰腺(E1.0组);CAT在血清(E0.5、E1.0、E2.5组)、肝胰腺(E0.5、E1.0、E10.0组);POD在血清和肝胰腺(E0.5、E1.0、E2.5组);SOD在血清和肝胰腺(E1.0组)以及MDA在血清(E1.0组)、肝胰腺(E0.5,E1.0组)较其他组均具有显著性差异(P＜0.05).研究表明,PHB添加剂对中国明对虾免疫水平的提高具有促进作用.综合各组和各时间段免疫酶的变化,E1.0为最适浓度组,投喂2-3周时其免疫酶总体具有高水平活力值.     

饲料中添加南极磷虾粉对凡纳滨对虾亲虾生长、性腺发育及脂肪酸积累的影响

为探讨人工配合饲料中添加磷虾粉对凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)亲虾性腺发育的影响,分别在饲料中添加0、10%、20%的南极磷虾粉,配制3组人工配合饲料(饲料组1、饲料组2和饲料组3)对12月龄的凡纳滨对虾进行了为期60 d的营养强化培养,并以投喂双齿围沙蚕(Perinereis aibuhitensis)为对照组。营养强化结束之后,比较分析了不同饲料组凡纳滨对虾亲虾的体重增重率、肝胰腺指数(HPI)和性腺指数(GSI);另外,检测分析了各组饲料以及亲虾性腺和肝胰腺的脂肪酸组成。结果表明,对照组的雌雄亲虾体重增重率均高于3个饲料组;饲料组2的HPI最低,为(2.37±0.02)%,与对照组无显著差异(P0.05);饲料组3的GSI与对照组无显著差异(P0.05),但两组的GSI均低于饲料组2,并且存在显著差异(P0.05)。同时,本研究还比较分析了饲料脂肪酸组成与亲虾性腺、肝胰腺脂肪酸组成的相关性以及对亲虾性腺发育的影响。结果显示,饲料中添加一定含量(10%~20%)的南极磷虾粉可在一定程度上成为凡纳滨对虾亲虾营养强化阶段的优良饲料。     

凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)育种核心群体在连续排污养殖模式下的生长和存活性能分析

利用配置连续排污系统的室外水泥池养殖凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei) 2012级育种核心群家系，监测、分析3个生长阶段养殖环境的水质变化、育种群体的生长和存活性能，为建立安全、高效的育种核心群体养殖模式提供基础数据。结果显示，在较高养殖密度(180 ind/m2)条件下，氨氮含量在7 d内从0达到1.80 mg/L的高峰值，在随后的养殖过程中呈波浪式变化，波动范围为0.50?1.80 mg/L；亚硝酸盐含量维持在低于0.60 mg/L的水平；pH值在7.2?8.2之间；溶藻弧菌、副溶血弧菌和哈维氏弧菌的含量分别为500?6200、0?400和0?10 CFU/ml；凡纳滨对虾的平均生长速率为0.199 g/d，养殖成活率达到89.7%；凡纳滨对虾体质量的生长符合Boltzmann和Logistic模型，体质量观测值与模型拟合值的决定系数(R2)分别为0.978和0.980，预测体质量规格为10?12 g时，为其体质量增长拐点。     

中国对虾抗病性状遗传标记筛选及遗传多样性分析

对人工选育的29个中国对虾半同胞家系进行人工感染WSSV后,选取存活时间最长和存活时间最短各29个个体,组成抗病群体和感病群体。用400个随机引物进行RAPD分析,得到与抗病正相关的特异性遗传标记5个,与抗病负相关的特异性遗传标记两个。15个随机引物在两个群体的扩增位点进行统计,共得到82个位点,其中多态位点34个,占41.46%,两个群体的多态位点比例分别为40.24%和37.8%。Shannon′s多样性指数估算两个群体的平均遗传多态度为0.2177,SLT群体的遗传多态度为0.2190略高于SST群体0.2163;群体内的遗传变异（HPOP/HSP）0.9645,可见96.45%的遗传变异来自于群体内,3.55%的变异来源于群体间。统计各座位的基因频率计算出两个群体的遗传分化指数为0.0294,表明两个群体并没有发生明显的遗传分化。     

中国对虾抗 WSSV 相关基因表达特征的 DDRT-PCR 分析

为了分析中国对虾(Fenneropenaeus chinensis)抗白斑综合征病毒(WSSV)相关的分子机理,本研究以中国对虾"黄海2号"作为实验材料,进行白斑综合征病毒感染实验,感染20d后获得了59尾存活的对虾。采用mRNA差异显示技术(DDRT-PCR)分析感染实验中早期濒死中国对虾和感染20d后仍存活对虾基因表达的差异,共回收到46个阳性差异片段。差异片段序列同源性功能分析的结果表明,差异片段所编码的蛋白主要参与氧化磷酸化、蛋白质合成、糖酵解、信号转导等生物过程。以上结果初步反映了中国对虾抗白斑综合征病毒相关基因的表达特征,为研究对虾抗白斑综合征病毒的作用机制及培育抗白斑综合征病毒对虾新品种提供了基础数据。     

热灭活WSSV诱导的中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)在不同温度下的免疫致敏反应

本研究拟探究经热灭活的白斑综合征病毒(White spot syndrome virus,WSSV)能否诱导中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)产生免疫致敏反应.将具有典型白斑综合征症状的对虾肌肉剁碎后经60℃灭活lh,采用单尾定量口饲的方法,连续6d投喂不同水温条件(15℃、23℃、28℃、32℃)下的实验组对虾(E15℃、E23℃、E28℃、E32℃);同时设置常温(23℃)条件下阳性对照组C23℃(投喂未经灭活的WSSV毒饵)、对照组CF23℃(只投喂商业配合饲料).在实验第13天对存活个体进行第二次人工WSSV感染,结果显示,WSSV经60℃处理lh可彻底失活,表现为连续投喂6d至第二次人工感染期间无对虾死亡,而阳性对照组C23℃死亡率为100％.截止实验第19天,E15℃、E23℃、E28℃、E32℃各组存活率分别为80.41％、33.29％、8.47％、16.43％,CF23℃组的存活率为8.89％,E15℃组与其他各实验组差异极显著(P＜0.01),E230℃与CF23℃、E28℃、E32℃组差异显著(P＜0.05),E28℃和E32℃组差异不显著(P＞0.05);对各组实验材料进行WSSV绝对荧光定量检测,结果显示,经热灭活WSSV诱导的中国明对虾二次感染WSSV后,28℃环境下病毒增殖速度最快,高温(32℃)和低温(15℃)都会不同程度抑制WSSV的增殖速度.实验表明,热灭活WSSV可以诱导中国明对虾产生免疫致敏反应,对受WSSV感染的中国明对虾具有一定的保护作用;温度与WSSV的增殖速度密切相关.     

聚β-羟基丁酸酯对中国对虾(Fenneropenaeus chinensis)亲虾的繁殖性能和幼体发育的影响

采用单因子浓度梯度法,在中国对虾(Fenneropenaeus chinensis)的生长和产卵阶段,对健康的中国对虾亲虾投喂添加不同含量聚β-羟基丁酸酯(PHB)(0、0.5％、1.0％、2.0％、3.0％、5.0％)的饵料,以期探究不同含量PHB对中国对虾亲虾的繁殖性能和幼体发育的影响.实验周期为192d,统计亲虾的死亡率、相对免疫保护率、增重率、特定生长率、性腺发育周期、产卵量、无节幼体的数量、孵化率及变态发育周期.结果显示,PHB对中国对虾亲虾的繁殖性能和幼体发育均有一定影响.随着PHB浓度的升高,死亡率呈先下降后上升趋势,而相对免疫保护率则呈现相反的变化趋势,其中,2.0％浓度组的死亡率最低,2.0％与1.0％浓度组差异不显著(P＞0.05),但与其他浓度组相比均差异显著(P＜0.05).亲虾实验组平均体重高于对照组,2.0％浓度组、5.0％浓度组与对照组相比差异显著(P＜0.05).在性腺发育周期方面,对照组与实验组无显著性差异(P＞0.05).实验组产卵量和无节幼体数量的平均值高于对照组,其中,2.0％浓度组与对照组相比差异显著(P＜0.05),但与其他实验组相比无显著差异(P＞0.05).对照组与各实验组在幼体的变态发育时间无显著性差异(P＞0.05).研究表明,PHB添加剂对中国对虾亲虾的繁殖性能和幼体发育具有促进作用,2.0％为最适浓度.