鳜鱼病毒核酸随机引物扩增与克隆↑（*）

从感染鳜鱼病毒（ Ｓｉｎｉｐｅｒｃａ ｃｈｕａｔｓｉ Ｖｉｒｕｓ,简称ＳＣＶ） 的鳜鱼体中分离病毒,提纯核酸作模板。通过ＲＡＰＤ 法,用带酶切位点的引物进行病毒核酸随机引物扩增,获得扩增带谱。从带ＥｃｏＲⅠ酶切位点的引物扩增产物中,用琼脂糖凝胶电泳回收大小约为０ ．４ 和０ ．５ Ｋｂｐ 的片段,经ＥｃｏＲⅠ酶切处理制备成带粘性末端的片段,分别插入质粒ｐＵＣ１９ 的ＥｃｏＲⅠ位点。ＥｃｏＲⅠ酶对重组子进行了酶切鉴定,获得２ 种带插入ＳＣＶ 核酸ＰＣＲ扩增产物的重组子。     

鳜塘底泥修复方法的初步研究

研究了6种不同处理方法对鳜（Siniperca chuatsi）塘底泥理化和生物性质的影响,并探讨了底泥理化因子和生物因子之间的相互关系。试验结果表明：1）池塘底泥经过处理后理化性质有所改变,碱化提高底泥酸碱度（pH）和可交换性钙含量,热熏显著降低底泥水分,提高碳/氮（C/N）;2）干燥、干燥后再破碎、施无机氮肥等手段能显著提高土壤呼吸强度（P〈0.05）,其中干燥后再破碎效果最显著,提高了52.3%;3）土壤理化因子中对土壤呼吸强度的直接影响力（按绝对值大小）排序依次为pH〉C/N〉有机质〉水分〉总氮（TN）〉总磷（TP）,而TN和TP对土壤呼吸的影响是通过其他理化因子间接表现出来的;4）综合评价结果显示,各修复方法中整体效果最好的是干燥后破碎,其次是干燥,碱化效果最差,综合得分分别为0.905、0.895和0.695。试验结果不仅为鳜塘连作障碍的克服提供理论依据,同时也为其他水产动物疾病的预防和健康养殖提供了新的思路。     

西伯利亚鲟停乳链球菌的分离、鉴定与致病性

从患暴发性流行病的两伯利亚鲟(Acipenser baerii)肝脏和心脏中各分离到1株细菌,分离纯化后获得2个分离株,编号分别为AeBF070904、AbHT070912,对分离菌进行了菌株鉴定、致病性分析及药敏实验.分别应用常规生理生化鉴定、全自动细菌测定卡API 20 STREP和ID 32STREP进行检测,结果表明,2个分离株均为停乳链球菌(Streptococcus dysgalactiae).对2个分离株的16S rRNA基因进行PCR扩增和测序,并与GenBank中收录的链球菌16S rRNA基因进行序列分析并构建系统进化树,结果显示,2个分离株的16S rRNA基因序列相同,与停乳链球菌同源性最高达97.3%,在系统进化树上与停乳链球菌聚为一簇,进一步确认2个分离株均为停乳链球菌.从人工感染后发病鱼的内脏组织再分离的细菌特性与原感染菌相同,确认停乳链球菌是西伯利亚鲟的致病菌.2个分离株对两伯利亚鲟、杂交鲟及剑尾鱼均有致死毒性,37℃培养的细菌毒力比28℃培养的细菌毒力强.2个分离株均对青霉素、诺氟沙星等7种药物敏感;对头孢唑啉、庆大霉素等2种药物耐受;对红霉素巾等敏感;对卡那霉素等8种药物菌株之间出现差异.     

草鱼肾中性粒细胞的分离鉴定与活性检测

分离纯化草鱼(Ctenopharyngodon idellus)肾中性粒细胞、鉴定和检测其活性, 目的在于为研究中性粒细胞的功能和免疫防御机制提供细胞材料。本研究使用鱼类脏器组织中性粒细胞分离试剂盒和差异贴壁法分离获得草鱼肾中性粒细胞; 应用迪夫氏染色、碘化钾-吡啰红 G (KI-Py G)染色、电镜技术鉴定细胞形态, 使用多功能酶标仪检测经 MPA 刺激的细胞活性, 台盼蓝染色法和 CCK-8 检测细胞存活率。结果显示, 获得的细胞大小均一, 细胞核圆形或肾形, 胞质有 A、B 型颗粒, 表面有皱褶, 具有中性粒细胞的形态特征; 细胞纯度达(99.3±0.53)%, 细胞活力达 (97.70±0.76)%, 在体外培养 24 h 内细胞存活率可保持在(89.91±3.56)%; 在 PMA 刺激下检测到细胞表达 MPO、 ROS、NO 和 NETs 的量显著提高(P＜0.05), 与刺激时间呈正相关。结果证实, 分离的细胞具有很好的活力, 具有中性粒细胞的功能特征。本研究成功建立草鱼中性粒细胞的分离方法, 细胞具有很好的活力, 可为深入研究鱼类中性粒细胞的功能和免疫机制提供基础。     

鳜淋巴器官的个体发育

运用连续石蜡切片技术和组织学观察方法,对常规孵化出膜后1～33日龄鳜(Siniperca chuatsi)淋巴器官个体发育过程的组织学特点进行研究。结果表明,水温23～25℃时,出膜后第4天,部分仔鱼开始摄食并逐渐转入外源性营养阶段。同样水温条件下,出膜后第3天,出现胸腺原基,然后胸腺迅速淋巴化,能明显分为外区、中区和内区。鳜在出膜时已存在原肾管,原肾管前部分发育为头肾原基,由一些造血干细胞和肾小管组成;后部分发育为中肾和后肾,主要由肾小管组成。随着个体发育,头肾的淋巴细胞数量增多,肾小管数量减少,头肾逐渐由排泄器官转化为淋巴器官。出膜后第5天,观察到脾脏原基,脾脏主要由造血细胞和淋巴细胞组成,淋巴化速度较慢。至出膜后30天左右,体形和淋巴器官的发育情况基本与成鱼相似。鳜淋巴器官原基出现的顺序是头肾、胸腺、脾脏;而这些器官淋巴化的顺序是胸腺、头肾和脾脏。     

鳜鱼病害防治新技术（二）

3.应用示例 珠江所曾对广东省不同养殖区的74口发病鳜鱼池塘进行调查,发现气候变化（降水、降温）对养殖鳜鱼池塘水生态因子有明显影响,降水、降温会引起浮游生物种群的改变，进而溶氧变化，最终影响鱼的健康。将74口发病池塘水质按优劣程度、病害按严重程度分级，发现鳜鱼病害发生与浮游生物多样性之间存在着相互关系（图3），池塘水体浮游生物多样性越低，     

鳜养殖池塘底泥脱氢酶活性测定方法的研究

对鳜养殖池塘底泥脱氢酶活性的测定方法中的反应条件(反应温度、反应时间、萃取剂、萃取时间和缓冲液的pH等)进行了研究.结果表明:在反应时间为30 min,缓冲液pH为8.4,反应温度为37℃,萃取剂为乙酸乙酯,样品萃取时间为1 h的条件下,对4个底泥样品中脱氢酶活性的重复测定结果显示,该方法有较高的精密度(变异系数≤5.89%).     

应用DGGE技术比较池塘人工生物膜与水体微生物多样性差异

[目的]为改善养殖的微生态环境提供参考。[方法]以无纺布为载体材料,采用PCR-DGGE技术比较了生物膜和水体微生物多样性的差异。[结果]电泳分析表明,总共检测到46条不同的条带。第4天,生物基与水体样品的条带数差异不明显。第8天时,二者出现了不同条带。在10~18天,生物膜多样性指数一直低于水体,直到第18~20天才开始高于水体。第12天时生物膜上优势菌种普遍存在,但是部分开始出现衰减和增强的趋势。Band1、5、6分别是生物膜上第8、12、16天出现的特征性条带,除假单胞菌属外,其他结果均为未得到分离培养或者未经过命名的菌类。水样中的特征条带Band3、4同爱德华菌、弧菌属的相似性分别为94%、87%。[结论]生物基载体可以改善池塘生物多样性。