黑曲霉糖化酶在酿酒酵母中的表达和分泌

从黑曲霉糖化酶高产株T2l合成的糖化酶cDNA,经5’端和3’端改造后克隆到酵母质粒YFDl8上,转化酿酒酵母。转化子的淀粉培养基平板检测,培养滤液蛋白电泳和糖化酶活力分析都表明,含有糖化酶基因表达质粒的酵母转化子能有效地分泌有功能的糖化酶到细胞外。实验证明酵母a园子启动子和分泌信号序列能促使黑曲霉糖化酶cDNA在酵母中表达和分泌．实验还表明．黑曲霉糖化酶原的翻译后加工序列很可能亦能被酵母识别,加工生成有功能的成熟的糖化酶。以上成功为构建有实用意义的淀粉水解酵母工程菌迈出了重要的一步。     

凝乳酶β-转角突变体的构建、表达和性质分析

为了阐明牛凝乳酶的第二个发夹结构中的Ⅵ型β转角的功能,利用基因突变技术,将该转角的氨基酸残基（Ｌｅｕ２０Ｇｌｙ２１Ｔｈｅ２２Ｐｒｏ２３Ｐｒｏ２４Ｇｌｎ２５）改为（Ｌｅｕ２０ＧｌｙＧｌｙＧｌｎ２５）、（Ｌｅｕ２０ＳｅｒＧｌｙＧｌｎ２５）或（Ｌｅｕ２０ＧｌｙＳｅｒＧｌｎ２５）,得到３个突变牛凝乳酶原表达质粒ｐＭＣＧＧ,ｐＭＣＳＧ和ｐＭＣＧＳ。除ｐＭＣＧＳ不能在大肠杆菌中表达外,ｐＭＣＧＧ和ｐＭＣＳＧ均能以包含体的形式进行表达,且表达水平与野生型相当。像野生型凝乳酶原一样,ｐＭＣＧＧ和ｐＭＣＳＧ的表达产物经过变性复性,均能自活化为假凝乳酶,而且复性后的酶原突变体在ＤＥＡＥＳｅｐｈａｒｏｓｅＣＬ６Ｂ上的柱行为与野生型相类似,但突变体假凝乳酶的凝乳及水解酪蛋白活性均明显低于野生型。说明突变对酶原的折叠影响较小,但对酶的催化效率影响较大。     

黑曲霉糖化酶基因表达调控的研究──Ⅱ.A.niger T21和3.795glaA基因5''调控区功能的体内分析

对糖化酶高产菌株A.nigerT21和原始菌株Aniger3．795的glaA5＇上游区的序列分析证明,两者在1．5kb的区域内有9个部位的碱基不同。为考察这些碱基差异是否是引起T21glaA基因转录水平提高的原因,构建了以T21和3．795glaA基因转录调控区及A．nidulans　trpC基因终止子为表达元件的E．colihph基因表达载体（pXH2和pGH1）,用pXH2和pGH1分别转化A.nigerT21,对两种转化子的HmB抗性水平测定和Southern杂交分析显示,在转化子XH2C和GH1C中,pXH2和pGH1以相同拷贝数（2拷贝串联）整合到染色体DNA的相同位置上,XH2C的HmB抗性水平（3000μg／ml）为GH1C（1500μg／ml）的2倍。这一结果表明,诱变引起的调控区序列改变使T21glaA基因转录调控区的功能水平比3．795提高1倍。     

Function of disulflde bond Cys45-Cys50 of prochymosin

The conditions (temperature, time, pH) for solubilizing inclusion bodies of prochymosin mutant, Cys45Asp/Cys50Ser, are identical with those for the wild type. Moreover, they have similar oxidative refolding behavior. Under the same renaturation conditions both of them can undergo correct refolding leading to the formation of activable molecules. This is quite different from the mutant with deletion of Cys250-Cys283, indicating that Cys45-Cys50 contributes less to the correct refolding of prochymosin than Cys250- Cys283. However, deletion of Cys45-Cys50 results in a remarkable decrease of the thermostability of pseudochymosin, suggesting that this disulfide bond plays an important role in stabilizing enzyme conformation. The proteolytic (P) and milk-dotting (C) activities of the mutant of pseudochymosin, Cys45Asp/Cys50Ser, are lower than those of its wild counterpart. The C/P ratio of the former is onefold higher than that of the latter.     

碱性条件下溶解包涵体提高凝乳酶原复性率的机制

重组凝乳酶原的复性效率不仅依赖于复性条件,而且与包涵体的溶解条件(即变性条件)有关.含有凝乳酶原的包涵体在pH11,8mol/L脲中溶解后,其复性率较在pH8,8mol/L脲中溶解的可提高1倍,由20%左右提高到40%左右.其机制是碱性条件有利于破坏分子间交联的二硫键从而增加凝乳酶原的溶解度.更为重要的是碱性条件使凝乳酶原分子处于一种还原性更强更为伸展的状态,这种状态容易进行正确再折叠.     

丝状真菌分子遗传学研究进展

丝状真菌作为低等真核生物,有典型的真核生物的细胞结构和遗传织组;作为微生物,又具有微生物在操作上的快速、简便,因此一向是生物学基础研究的重要材料。丝状真菌又是重要的工业生产用菌株和多种农作物的致病菌,这就更刺激了生物学家对研究丝状真菌的兴趣。     

神经元钙稳态失衡在阿尔茨海默病发病中的进展

淀粉样蛋白的沉积与Tau蛋白磷酸化是阿尔茨海默病发病的关键分子机制,神经元胞内钙离子的变化可影响其生成和代谢;另一方面,这些蛋白的改变会进一步导致神经元钙稳态的失调,致使突触损伤、神经细胞凋亡及认知功能下降。本文就神经元钙稳态失衡在阿尔茨海默病发病中的进展进行综述。     

一种制备poly(Ⅰ)·poly(C)-滤纸的新方法

poly(1)·poly(C)-滤纸是一种亲和材料,可以用来吸附与双链核酸有亲和力的酶或蛋白。本文介绍用对-β硫酸酯乙砜基苯胺为活化剂制备poly(I)·poly(C)-滤纸的方法。poly(I)·poly(C)的结合容量为10—35μg/cm~2,用来吸附兔网织红细胞裂解液中2’-5’A合成酶效果良好。在一定范围内,酶活与被吸附裂解液量呈线性关系,说明可以用来定量检测未知样品中与poly(I)·poly(C)有亲和力的酶。poly(I)·poly(C)-滤纸在-20℃保存四个月亲和能力不变。本方法与文献报道的方法相比,操作简便试剂易得。