phoA基因的克隆和一种原核分泌表达筛选载体的构建

外源基因在原核细胞中的表达,是基因工程和分子生物学许多研究领域中应用最为广泛的技术,大肠杆菌已成为蛋白质表达的首选宿主和生产基因工程多肽药物的主要表达系统。发展通用的高表达、可溶性以及分泌性表达策略,是目前该领域研究中的重点发展方向。实现外源基因在大肠杆菌中的分泌表达,由于对蛋白质分泌机制的基础研究还不够深入,缺乏有力的理论指导,目前还存在许多问题,急需要发展新的研究技术和思路。研究表明,表达蛋白的性质是决定它能否有效分泌的重要性质,蛋白质中少数氨基酸的改变可显著的影响其分泌情况。为了能够方便的…     

从小牛胸腺分离纯化末端脱氧核苷酸转移酶

本文采用Okamura氏的寡聚脱氧胸苷酸(oligo-dT)-纤维素柱层析法分离纯化小牛胸腺末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)。包括下列主要步骤:制备酶粗提液、磷酸纤维素柱层析、二乙基氨基乙基纤维素柱层析、葡聚糖凝胶过滤、oligo dT-纤维素亲和层析。经过上述几步分离纯化,从500克小牛胸腺中获得6,564单位TdT,比活性达5,199单位/毫克蛋白,聚丙烯酰胺凝胶电泳呈一条带,不含脱氧核糖核酸(DNA)多聚酶Ⅰ。     

金黄色葡萄球菌肠毒素A的基因克隆、表达及活性试验

利用PCR从金黄色葡萄球菌标准株（Staphylococcus aureus, ATCC13565）中克隆了金黄色葡萄球菌肠毒素A(SEA)的基因,序列测定结果与报道完全一致。构建了表达载体pETSEA并获得高效表达,重组蛋白（rSEA）在37℃诱导时以包涵体形式存在,降低温度则出现可溶表达,可溶性rSEA占总rSEA的55%。可溶性rSEA经Ni²⁺亲和层析纯化,达电泳纯。通过同源模建对rSEA对SEA进行结构比较,结果表明尽管rSEA比野生型SEA多了9个氨基酸但其结构并没有明显的变化。单核细胞增殖试验进一步证明了该结论：将rSEA与SEA同外周血单个核细胞共同培养,两者均能有效地促进其增殖。将rSEA与体内激活的脾细胞共培养,则能增强脾细胞的体外抑瘤活性。     

糖多孢红霉菌A226 的原生质体转化和染色体同源整合

糖多孢红霉菌的原生质体转化和染色体同源整合,是红霉素生物合成基因改造的重要途径。本研究对糖多孢红霉菌A226原生质体制备和转化条件进行了优化,结果表明以对数生长后期和稳定期菌丝体制备的原生质体转化效率较高;质粒、原生质体和PEG－T缓冲液体积比例为15：40：200（μl)时转化效果较好;比重小原生本的转化效率虽高,但在转化子中有效整合的比例较低;PEG1000和PEG3350对转化效率没有显差异;而Yamamoto转化系统优于Weber转化系统。PCR鉴定、抑菌活性鉴定和质谱分析均表明,转化质粒已整合到染色体红霉素合成基因位点。     

O139霍乱弧菌质粒基因组文库的建立及O抗原基因的筛选

合成O抗原的基因是串联在一起的一个基因簇,提取O139霍乱弧菌基因组DNA,限制性内切酶EcoRⅠ酶切,电泳回收4～20kb的DNA片段,构建质粒基因组文库。随机筛选重组克隆,获得一株可与O.139霍乱弧菌抗血清发生凝集反应的重组克隆,命名为大肠杆菌DH5α(pMG320)。经鉴定分析重组克隆所表达的O抗原具有良好的免疫原性及反应原性。酶切分析质粒pMG320,推知其O抗原基因大小约4.6kb。这为今后O.139霍乱疫苗的研制及O.139霍乱弧菌O抗原基因的结构和功能研究提供了条件。     

人粒细胞集落刺激因子(G-CSF)cDNA的克隆和序列测定

用Ficoll-Paque从正常中国人外周血中分离单个核细胞,在RPMI 1640培养基(含10％小牛血清,2mrnol/L谷氨酰胺)中培养2小时,洗涤去除未贴壁细胞,将贴壁单核细胞用含10μg/mLLPS的培养基继续培养2小时。用异硫氰酸胍-酸酚法提取LPS诱导后的单核细胞总RNA,从中取1μg.总RNA作模板,以oli-go(dt)_(15)为引物,使用Promega公司AMV逆转录酶     

冻干口服霍乱rBS—WC菌苗安全及保护效果评价的小鼠模型探讨

本文仿照人口服免疫程序用小鼠为模型对冻干口服霍乱ｒＢＳ－ＷＣ菌苗制品进行了安全及保护率评价。给ＫＭ小鼠口服三种不同剂量的ｒＢＳ－ＷＣ菌苗后,无发病,无体重减轻,无死亡现象,表明该菌苗安全,无毒副作用。免疫组与安慰剂组小鼠用肠结扎攻毒试验评价保护效果,两组小鼠用吴江－２及滨－４３活菌攻击后,免疫组显示良好保护作用（Ｐ＜０．０５）。此法可以用于口服型ｒＢＳ－ＷＣ菌苗的评价,但也存在需要动物数较多,个体间差异较大,手术较麻烦的问题。     

一种适于蛋白质测序仪分析的蛋白质样品预处理方法

氨基酸序列自动分析仪大大提高了氨基酸序列分析的速度,但碰到的问题是供分析用的蛋白质样品的纯度不易掌握,常常半途中断分析过程。以ABI 470A/900A机为例,每设置10～15个氨基酸的分析,在许多情况下只分析到一半或多一些即被中断。该机为ODS-C18反相柱型,经化学处理的逐个氨基酸按各自在该柱的保留时间被仪器区分开并记录下来。我们选用此机型来分析工程菌产霍乱毒素B亚单位(rBS)。由于我们的rBS是新型口服霍乱疫苗的成分之一,国家药政部门要求分析N端20个氨基酸     

冻干口服霍乱rBS-WC菌苗安全及效率评价的小鼠模型探讨

我们构建了高产、分泌霍乱毒素B亚单位的工程菌株E.coli MM2,并用该菌株生产的重组霍乱毒素B亚单位(rBS)与灭活霍乱弧菌菌体制成冻于口服rBS-WC菌苗。这一菌苗的实验室动物研究亦已进行,肯定其在多种动物安全、有效。目前已能较大量地生产rBS,正在探索放大与工业化生     

乙型肝炎病毒DNA克隆的菌落原位杂交

在遗传工程的DNA 重组试验中,需从大 量的转化子中筛选含特殊DNA 序列的克隆, 尤其是当被克隆的基因中无选择标记时,应用 菌落原位杂交进行筛选是最理想的。其主要 优点是特异性强,因此它成为DNA体外重组 实验的重要方法之一。为了便于使Grunstein 等〔习的菌落原位杂交法在我国推广应用,我们 对Grunstein等的方法作了适当修改,并对影 响实验结果的几个主要因素作了初步比较。采 用本修改方法筛选含乙型肝炎病毒DNA的克 隆的结果表明,此法是特异而可靠的。