大肠杆菌MG1655菌株ERIC-PCR图谱主带序列组成分析*

ERIC PCR已经在细菌分类、鉴定及混合菌群分析中得到广泛应用 ,但对其产物形成规律的认识仍存在分歧。以大肠杆菌MG1 655为对象 ,对其ERIC PCR指纹图谱中 1 1kb主带中的DNA片段进行了克隆、测序、基因组定位以及引物匹配分析。结果表明 ,这条1 1kb主带由分布在基因组中不同位置的 3种序列不同的片段组成 ,各片段的丰度差异较大 ,最高为 97 89% ;3种片段中的 2种所在的基因组区域仅一端含有ERIC序列。推测对含有ERIC序列的基因组DNA进行扩增时 ,ERIC PCR是一种非随     

转HrpN的工程菌E4对水稻根际细菌群落结构的影响*

采用单一碳源回收菌群的方法与ERIC PCR方法相结合 ,检测水稻 (Oryzasativa L )根际施用转基因微生物E4(EnterobacteriacloacaeE4)后 ,其根际微生物的群落结构和多样性的变化 ,进而推测转基因微生物E4在田间施用的安全性。结果表明 :转基因微生物E4施用到水稻根际后 ,水稻根际的代谢指纹图谱和DNA指纹图谱都发生了改变 ,采用southernblot ting检测显示 :E4成为根际的优势菌 ,这对植物生长有利 ,应该不会造成不利的影响     

马传染性贫血病毒弱毒疫苗株跨膜蛋白截短突变对其体外复制特性影响

马传染性贫血病毒(EIAV)减毒疫苗是世界首例慢病毒疫苗,但其作用机理尚不明了.研究发现,EIAV疫苗株EIAVFDDV12的跨膜蛋白gp45在马体内发生高频率261W位点翻译终止突变,使该蛋白质C端出现154个氨基酸的截短.为了探讨该截短对EIAV疫苗株生物学特性的作用,以EIAV弱毒疫苗株感染性克隆为骨干,构建了gp45截短型感染性病毒株,检测该截短突变对EIAV疫苗株在体外培养的马外周血单核细胞由来的巨噬细胞(MDM)、驴MDM和驴胎皮细胞(FDD)中的复制.实验结果表明,gp45截短型毒株在马和驴MDM中复制能力比未截短型毒株显著降低(P<0.01),特别是在马MDM中此差异更明显.相反,截短型毒株在FDD中的复制能力则显著高于未截短型毒株(P<0.01).此外,结果显示gp45截短型毒株在马MDM中的低水平复制降低了EIAV对其靶细胞诱导的凋亡.以上结果提示,EIAV疫苗的gp45截短型毒株是适应在体外FDD细胞中传代致弱的变异,该变异导致疫苗株在EIAV体内主要靶细胞巨噬细胞中复制能力的降低,导致毒力进一步减弱.     

CVTree在454高通量测序分析菌群结构中的应用

目的探究将基于短串频度的CVTree方法用于反映菌群结构的16S rRNA基因的454高通量测序数据分析的可行性,为快速分析高通量菌群结构数据提供新的方法。方法对一个四世同堂的中国家庭7名成员肠道菌群和不同基因型及饮食类型的小鼠肠道菌群用454高通量方法获得16S rRNA基因的V3区的测序数据,用CVTree的方法进行菌群结构的比较分析。结果通过选取合适的短串长度,CVTree的方法能准确检测到各样本间的聚类关系,其结果与之前文献报道的基于Unifrac算法的结果相一致。结论CVTree能快速、有效地处理16S rRNA基因的454高通量测序数据,实现对不同菌群结构相似性的比较分析。     

健康人肠道中溶血菌的调查与分子鉴定

目的 调查无临床症状健康人肠道内有无溶血菌的存在,并利用分子方法对溶血菌进行鉴定。方法 通过血平板分离培养,对17例无临床症状个体肠道内溶血菌的存在情况做了3周的动态调查,对分离到的溶血菌的16SrDNA进行ARDRA（Amplified Ribosomal DNA Restriction Analysis）酶切分型,将溶血菌分为不同类型,最后利用ERIC—PCR指纹图谱技术对不同类型的溶血菌进行菌株水平的鉴定。结果17例个体中发现5例个体能检测到溶血菌,其中4例个体（A～D）只有1次样品检测到溶血菌,而个体E在3周的5次采样中均能检测到溶血菌。根据ARDRA酶切图谱将溶血菌分为2种类型,Ⅰ型16SrDNA全长测序后与蜡状芽胞杆菌（Bacillus cereus ATCC 10987）序列同源性达99％,Ⅱ型与大肠埃希菌菌（Escherichia coli CFT 073）的16SrDNA序列同源性达99％。结论 在健康个体肠道内也有溶血菌的存在,且溶血菌的存在可能与机体的疲劳程度和饮食情况有关。     

从粪便样品中检测动物冠状病毒的分子技术研究

目的 感染冠状病毒的动物向环境排毒主要是通过粪便,建立直接从粪便样品对动物冠状病毒进行检测的分子技术具有重要的公共卫生学意义。方法 通过计算机模拟和实验方法对已报道的2对针对冠状病毒pol基因的通用引物的通用性进行了验证。不经传统的病毒分离．直接从环境样品中提取病毒RNA,通过一步法RT-PCR进行检测,并通过分子杂交和Nested PCR扩增结合TaqMan探针实时荧光检测的PCR技术．提高对冠状病毒检测的灵敏度和准确度,并对猪、禽冠状病毒感染的临床样品进行分析检测。结果 2对引物可以覆盖所有已知的冠状病毒,包括SARS,RT-PCR产物通过测序可以确定冠状病毒种类;实时荧光定量NestedPCR有很高的灵敏度,可以灵敏地检出所有供试的阳性样品,而荧光增量实时监测可以排除凝胶电泳检查的假阳性。结论 该研究为从环境中普查和鉴定冠状病毒提供了可靠的技术方法。     

PCR指纹图谱技术分析人体口腔内微生物菌群结构

目的 应用PCR-DGGE指纹图谱技术对人体口腔微生物菌群结构进行系统性研究.方法 对1例健康人唾液周期性采集的样品和8例健康人个体的唾液与牙菌斑采集的样品,进行微生物群落总DNA的抽提.以此为模板扩增16S rRNA V3可变区,产物经DGGE指纹图谱分析其组成结构,并运用UVIBAND/MAP等软件比较所得群落指纹图谱的相似性指数.结果 同一健康人个体不同采样时间的唾液菌群结构相似性系数＞74%,通过对不同健康个体口腔样本的研究,发现同一个体的唾液与牙菌斑菌群结构存在差异（84%～95%）.结论 同一健康个体其唾液微生物菌群在一定时间内基本稳定,仅有微小的变化;唾液与同个体牙菌斑的微生物组成虽然存在差异,但这种差异要明显小于个体间的差异.     

三氯乙烷污染地地下水中Dehalobacter属细菌定量与多样性分析

[目的]对某公司6个以1,1,1-三氯乙烷(1,1,1-Trichloroethane,1,1,1-TCA)为主要污染物的地下水样品中的降解微生物Dehalobacter spp.(Dhb)进行相对定量和多样性分析.[方法]采用气相色谱法测定6个样品中1,1,1-TCA、1,1-二氯乙烷(1,1-DCA)和氯乙烷(CA)的浓度;通过定量PCR法分别测定6个样品中Dhb占总菌的百分比;以16S rRNA基因通用引物和Dhb特异性引物扩增获得的PCR产物构建了6个样品的Dhb特异性克隆文库,所得序列与GenBank中的最相似序列构建系统发育树.[结果]6个样品中均有1,1-DCA和(或)CA的检出,推测此6处地下水中1,1,1-TCA可能存在生物降解.定量PCR结果表明,6个样品中Dhb丰度差异较大.6个Dhb特异性克隆文库获得41条序列,序列比对结果表明,与它们最相似的已知分类地位的序列全部属于Dhb属.这些序列按99％的相似性被划分成7个可操作性分类单元(OTU).其中24条序列属于OTU1,该OTU的序列与已知能阵解1,1,1-TCA的Dehalobacter sp.str.TCA1的16S rRNA基因序列相似性达98％;文库中的3个OTU与GenBank中16S rRNA基因序列同源性最高仅为95％-96％.[结论]该污染场地地下水中存在多样性较丰富的降解微生物Dehalobacter属细菌,它们可能与现场的1,1,1-TCA生物降解有关.     

粪便提取液毒性检测方法的建立及应用

目的建立检测人体粪便提取液对肠上皮细胞毒性的方法。方法以Caco-2细胞为体外模型,应用建立好的毒性检测方法：用MTT法（四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法）检测细胞毒性,用单细胞凝胶电泳技术检测遗传毒性,对糖尿患者和健康人的粪便提取液进行分析。结果糖尿病患者粪便提取液的细胞毒性显著高于健康人（n=30,P〈0.05）;其遗传毒性显著高于阴性对照PBS（P〈0.05）,与健康人相比有升高趋势,但差异无统计学意义。结论粪便提取液的毒性检测方法可以简便、有效地检测人体粪便中毒性物质对肠上皮细胞的影响,因此可作为评价肠道菌群状态的方法。     

TGGE分析焦化废水处理系统活性污泥细菌种群动态变化及多样性

应用TGGE指纹图谱技术对两个曝气池细菌种群的动态变化及多样性进行了研究。每3d进行1次,共8个监测时期中同一曝气池活性污泥的16SrDNAV3-PCRTGGE指纹图谱基本一致,图谱间的相似性系数(Cs)为100％。同一曝气池不同位点活性污泥的TGGE指纹图谱也完全一致。功能不同曝气池活性污泥TGGE指纹图谱存在差异,Cs为83．3％。对TJ1活性污泥TGGE图谱中9条主要条带回收、扩增、克隆建库,每个条带选4个转化子进行序列分析,结果显示TGGE条带是由序列不同的片段组成。32个序列在97％的相似性下分成16个分类操作单元(OTU),14个OTU与GenBank中已登录的细菌种群的同源性≥97％,2个OTU的同源性为95％和94％。与10个OTU同源性较高的细菌类群是在活性污泥或污染环境分离或发现的,与8个OTU相似的细菌类群目前尚无法分离培养。