番木瓜种子原生质体制备技术的研究

以番木瓜（Carica papaya L.）成熟种子为材料,通过正交和单因素实验研究不同酶液浓度、甘露醇浓度、酶解时间、酶解pH等因素对番木瓜种子原生质体分离的影响。结果表明,高存活的番木瓜种子原生质体分离最佳条件是酶液组成为2.2％纤维素酶+0.6％离析酶、甘露醇浓度为0.7 mol/L、酶解9 h、酶解pH值为5.5。本研究奠定了原生质体遗传转化的基础,为番木瓜种子相关活性物质代谢途径的研究创造了良好的条件。     

一步法RT-PCR扩增PRSV海南分离物全长基因组cDNA

以植物总RNA提取试剂盒提取的高纯度的总RNA为模板,使用Oligo dT-Adaptor和Random9引物合成了番木瓜环斑病病毒海南分离物(PRSV HN-2)的cDNA第一链,基于已报道的PRSV全长基因组序列,设计合成了一对引物,一步法RT-PCR扩增出PRSV海南分离物全长基因组cDNA。为了验证获得的全长基因组cDNA的正确性,并以扩增出的全长cDNA为模板,将PRSV全长基因组分成A、B 2个大片段进行扩增,应用T载体进行克隆和测序以验证所获得的全长基因组cDNA序列的正确性。测序结果显示,该cDNA序列与国内外报道的PRSV各分离物全长核苷酸序列的相似性很高,表明本文建立的一步法RT-PCR扩增PRSV全长基因组cDNA的方法正确、可行。     

番木瓜果实总RNA提取方法比较

通过吸光比值分析和非变性胶电泳,对番木瓜果实RNA不同提取方法进行了比较研究,结果表明,Trizol试剂法提取番木瓜果实RNA的OD260/OD230值在1.63～1.97、OD260/OD280值在1.79～2.00之间,具有方便快捷、完整性好、受多糖多酚影响较少以及无DNA和蛋白质污染等优点,对类似番木瓜果实成分的其他作物的RNA提取具有一定的借鉴意义.     

槟榔Catalase基因的克隆及亚细胞定位

过氧化氢酶（Catalase）广泛存在于生物体内,主要功能是清除植物细胞内光呼吸、线粒体电子传递及脂肪β-氧化等过程中产生的H₂O₂,从而保护细胞免于过氧化氢酶的毒害。为了解槟榔过氧化氢酶基因的相关信息,利用植物总RNA提取试剂盒提取槟榔叶片总RNA,通过同源克隆和RACE技术获得槟榔全长cDNA,并对其进行生物信息学分析及亚细胞定位。结果表明：获得ArCAT1（MN692600）、ArCAT2（MN692601）、ArCAT3（MN692602）3个同源基因,其序列全长均为1476 bp,编码492个氨基酸。遗传进化分析显示,ArCATS与同为棕榈科的油棕（Elaeis guineensis）、海枣（Phoenix dactylifera）等植物的过氧化氢酶氨基酸序列具有较高的相似性,其中与油棕的亲缘关系最近。亚细胞定位结果表明,ArCAT1蛋白定位于过氧化物酶体中,而ArCAT2和ArCAT3既定位于过氧化物酶体又定位于细胞核中。这为进一步研究Catalase基因在槟榔中的生物学功能奠定基础。     

PEG介导番木瓜叶肉原生质体瞬时表达体系的建立

本研究对聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)的分子量、浓度及处理时间等三个影响番木瓜叶肉原生质体转化效率的主要因素进行了优化,同时利用绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)表达体系进行了转化表达分析。结果表明:经40%PEG8000溶液处理10 min,可使GFP在原生质体中的平均转化率达到45.26%;沉默抑制载体p Green-Hcpro和GFP瞬时表达载体共转化番木瓜叶肉原生质体,可使GFP在原生质体中的平均转化率进一步提高到68.75%,相比单独转化瞬时表达载体p RNAi-GFP增长了51.90%。PEG介导番木瓜叶肉原生质体瞬时表达体系的建立为番木瓜功能基因组和基因功能研究奠定了基础,可为热带作物的研究提供又一模式作物,推动热带作物在分子及细胞生物学领域的发展。     

番木瓜eIF(iso)4E基因克隆及其结构和表达分析

 eIF4E ( eukaryotic translation initiation factor 4E) 家族基因在多种病毒侵染植物过程中起重要作用。应用RT-PCR和RACE方法在番木瓜中克隆了cDNA全长为995 bp的eIF4E异构体基因, 命名为CP-eIF(iso)4E(GenBank登录号为FJ595992) 。其编码的蛋白含有206个氨基酸, 蛋白一级结构中的活性部位位点高度保守, 三维结构中可能的抗性位点位于帽结合区域( cap-binding pocket) 表面。半定量RT-PCR结果表明, CP-eIF ( iso) 4E在番木瓜叶片中表达较弱, 在花瓣中表达最强。     

PRSV运动相关病毒蛋白的Sos恢复系统诱饵载体构建及自激活效应检测

为研究与番木瓜环斑病毒运动相关的病毒蛋白(CP、HC-Pro、CI)互作的寄主因子,构建以Sos恢复系统为原理的胞质酵母双杂交系统的3个病毒蛋白诱饵载体,并检测其自激活作用来验证是否适用于后续的文库筛选.通过RT-PCR从番木瓜环斑病毒海南分离物中扩增出这3个病毒蛋白的片段,按正确方向将目标片段分别插入诱饵载体pSos中,并将重组质粒导入酵母温度敏感酵母菌株cdc25H,检测其表达产物对酵母Sos恢复系统Ras信号通路的激活作用而产生的细胞温敏特性影响.结果表明,这3个含番木瓜环斑病毒运动相关的病毒蛋白的诱饵载体构建正确,对酵母菌株cdc25H的Sos恢复系统无激活作用,激活试验为阴性.     

甘薯羽状斑驳病毒海南分离物全基因组序列克隆及分析

为了明确海南本地甘薯羽状斑驳病毒(sweet potato feathery mottle virus,SPFMV)种群的遗传进化关系及致病机理,本研究利用Small RNA测序技术对采自海南的甘薯样品进行鉴定,获得与SPFMV序列具有相似性的85个contigs,与NC_001841相似性较高。试验设计了5对共8条引物,分别为SPFMV-1F/1R、SPFMV-11F/1R、SPFMV-2F/2R、SPFMV-3F/3R和SPFMV-3F/33R PCR,扩增获得3987 bp、3710 bp、1996 bp、3369 bp和4730 bp目的片段。在此基础上再分段设计引物,进行基因全序列PCR扩增,序列拼接获得SPFMV-HN基因组全序列,其包含完整编码阅读框。本研究结果首次报道SPFMV海南分离物基因组全长,并且在P1区预测到另一个外框元件(pretty interesting sweet potato potyviral ORF,PISPO),聚合酶滑移机制可以产生带有额外核苷酸的转录变体,这些核苷酸可以翻译为P1N-PISPO和P3N-PIPO。本研究结果为进一步探究SPFMV致病分子机理和培育抗病甘薯品种奠定研究基础。     

应用Sos恢复系统筛选与番木瓜环斑病毒CI互作的寄主因子

应用Sos恢复系统(Sos recruitment system)筛选可能与番木瓜环斑病毒CI(Cylindrical inclusion protein,圆柱形内含体蛋白)相互作用的寄主蛋白因子,通过营养缺陷、温度敏感筛选、回转验证、序列测定和同源比对分析,获得1种候选的互作寄主蛋白,该蛋白与植物的叶绿体延伸因子Tu(Elongation factor Tu,EF-Tu)具有较高的相似性,并对其在番木瓜环斑病毒(Papaya Ringspot Virus,PRSV)致病与植物防御过程中的功能进行初步分析。     

原核表达dsRNA抗番木瓜畸形花叶病毒的研究

番木瓜畸形花叶病毒(Papaya leaf distortion mosaic virus,PLDMV)是一种已对番木瓜种植业构成潜在威胁的新型病害,在转基因植物备受争议的背景下,利用原核表达的dsRNA来防控病毒的策略不失为一种新的选择。本文选取PLDMV CP基因全长(879 bp),运用OZ-LIC法构建了含有pdk内含子的ihpRNA结构,将其嵌入原核表达载体pSP73中,并转化RNaseⅢ缺陷型大肠杆菌M-Jm109LacY,构建了1种能高表达dsRNA的原核表达菌株M-Jm109LacY-CP879,以终浓度为0.4 mmol/L IPTG诱导后能够稳定高效的表达CP879-dsRNA。研究共设2个处理:保护性处理与治疗性处理。分别用含有CP879-dsRNA的粗提液对这2个处理的番木瓜植株进行喷施处理,通过统计发病率、观察病症变化以及ELISA分析结果表明,保护性处理能有效抑制番木瓜畸形花叶病毒的侵染,主要表现为发病时间推迟和相对较低的发病率;治疗性处理植株的病毒积累量会在喷施后第3~12天内出现暂时性的降低。结果表明,保护效果优于治疗效果,若每月喷施2~3次dsRNA粗提液,有望能够有效地预防PLDMV的侵染。