隐鳃鲵科的生物地理与种群遗传研究进展

隐鳃鲵科(Cryptobranchidae)现存2属3种,其中大鲵属(Andrias)有2个种,即分布于我国的中国大鲵(A.davidianus)和分布在日本的日本大鲵(A.japonicus);隐鳃鲵属(Cryptobranshus)仅有隐鳃鲵(C.alleganiensis)1种,分布于美国东北部,又称美洲大鲵。由于人类活动的干扰,例如水库修建、森林砍伐、矿山开采、化肥农药使用等导致隐鳃鲵科的物种栖息地遭到严重破坏。此外,过度捕捞使隐鳃鲵科的自然种群数量不断下降,甚至造成某些种群的灭绝。目前,隐鳃鲵科这3个现存物种都处于不同程度的濒危状态。结合现有资料,分析、概述了隐鳃鲵科的生物地理学特点及其种群遗传学研究进展,旨在为其自然种群保护提供参考。     

长江江苏溆浦段2015 年发现中华鲟野生幼鱼的形态和分子鉴定

在葛洲坝下中华鲟(Acipenser sinensis)产卵场连续两年未监测到自然繁殖的情况下,2015年6月在江苏溆浦段发现15尾疑似中华鲟幼鱼。本研究通过形态学和分子生物学方法对该15尾幼鲟进行鉴定。形态学度量结果显示,除1尾个体外,新发现的14尾幼鲟与历史记载的中华鲟野生幼鱼生物学性状完全一致,但其体长和体重低于历史同期出现在该区域的中华鲟。同时采用11个多态微卫星位点,对15尾幼鲟样本和分布于我国的3种鲟鱼,包括30尾中华鲟(A.sinensis)、39尾达氏鲟(A.dabryanus)和33尾施氏鲟(A.dabryanus)进行遗传分析,发现这15尾幼鲟与中华鲟的遗传距离最近(F_(st)=0.039,P0.05),其次为达氏鲟(F_(st)=0.108,P0.05),最远为施氏鲟(F_(st)=0.209,P0.05),从遗传和进化的角度判定该批幼鱼为中华鲟,该结果暗示中华鲟在葛洲坝下游极有可能找到了新的产卵场,为中华鲟的繁殖群体和幼鱼的种群监测提供了依据。遗传多样性分析显示,该批鱼的遗传多样性(SW=1.998)略低于野生中华鲟(SW=1.886),暗示中华鲟幼鱼遗传多样性水平降低,野生亲本的数量仍不容乐观。     

中华鲟IFN-γ 的免疫调控作用

为了解中华鲟IFN-γ的免疫调控作用,实验通过中华鲟转录组获得IFN-γcDNA序列,构建重组表达质粒pTRI-st-IFNγ,原核表达IFN-γ蛋白,检测其在病毒和细菌感染过程中的免疫调控作用。SDS-PAGE显示,中华鲟IFN-γ重组蛋白大小为19.17 ku,以可溶性表达为主,浓度为0.998 mg/mL;荧光定量PCR显示,IFN-γ蛋白能够诱导中华鲟肾脏细胞中下游相关抗病毒基因Mx、Viperin和CXCL家族中CXCL11-L1、CXCL11-L2表达;与EPC细胞共孵育能够有效抑制鲤春病毒血症病毒(spring viraemia of carp virus,SVCV)引起的细胞病变和增殖,并对SVCV病毒的G、P、N 3个基因表达量呈现出极显著性下调;在体外能够调控抑制嗜水气单胞菌、中间产气单胞菌和维氏气单胞菌并对其生长表现出明显的抑制作用。     

达氏鲟gdf11基因cDNA的克隆及组织表达特征分析

本研究克隆了达氏鲟(Acipenser dabryanus)生长转化因子gdf11(growth differentiation factor 11)基因cDNA。达氏鲟gdf11基因cDNA序列全长1 298 bp(不包括Poly A),开放阅读框为1 191 bp,编码396个氨基酸,5非编码区长19 bp;3非编码区长88 bp。通过Signal P软件预测含有N端21aa的信号肽。组织表达特征分析结果显示,gdf11在7种组织中均有表达,在眼和鳃中的表达量较高;不同水流条件下,鳃和心脏gdf11的表达量有显著性差异,静水中鳃gdf11表达量是流水(流速27.0±3.0 cm/s)的4.70倍,而心脏中的表达量是流水的2.72倍。这暗示了gdf11可能在呼吸代谢中发挥功能。     

达氏鲟自噬基因MAP1LC3B克隆及其组织表达分析

[目的]掌握达氏鲟微管相关蛋白1A/1B轻链3B基因(MAP1LC3B)的表达模式,为后续研究MAP1LC3B基因功能及揭示达氏鲟的抗病分子机制提供理论依据.[方法]采用RACE技术从达氏鲟组织中克隆MAP1LC3B基因,通过ProtParam、TMpred、Phyre2及Singal 4.1等在线软件进行生物信息学分析,同时借助实时荧光定量PCR检测MAP1LC3B基因在达氏鲟不同组织中的表达情况.[结果]达氏鲟MAP1LC3B基因cDNA序列全长2208 bp,包含378 bp的开放阅读框(ORF)、202 bp的5'端非编码区(5'-UTR)和1628 bp的3'端非编码区(3'-UTR),编码125个氨基酸.MAP1LC3B氨基酸序列含有GABARAP泛素结构域、Agt7结合位点、脂化位点和维管束蛋白结合位点.达氏鲟MAP1LC3B蛋白由18种氨基酸组成,其中谷氨酸(Glu)含量最高(占9.6%)、丙氨酸(Ala)含量最低(占1.6%);蛋白分子量为14743.01 Da,理论等电点(pI)为8.92,不稳定系数为65.12,总平均亲水性为-0.484,是一种不稳定的疏水性蛋白,且不存在跨膜结构,也无信号肽序列.MAP1LC3B基因在达氏鲟鳃、脑、皮肤、头肾、前肾、脾脏、中肾、心脏和肠道等组织中均有表达,以在鳃和肠道组织中的相对表达量较高,显著高于在其他组织中的相对表达量(P<0.05).[结论]达氏鲟MAP1LC3B基因具有较高的保守性,在鳃和肠道黏膜免疫组织中高表达,表明自噬参与达氏鲟黏膜免疫过程,调节机体免疫反应.     

牛结核病抗体胶体金快速检测技术的建立和应用

为了建立一种快速检测牛分支杆菌抗体的新方法用于诊断牛结核病,利用胶体金免疫层析技术原理,用原核诱导表达的牛分支杆菌抗原蛋白MPB83和MPB70分别作为胶体金标记抗原和检测线上的捕获抗原,制备牛结核抗体检测试纸条.结果表明,粒径为40 nm的胶体金制备的试纸条敏感性最高,胶体金最佳标记pH为6.0,MPB83抗原最适标记量为每毫升胶体金6.5 μg,MPB70抗原的最适包被浓度为3.0 mg/mL,抗MPB83蛋白IgG的最佳包被浓度为2.5 mg/mL,交叉试验证明试纸条不与牛的其他非相关疾病的阳性血清反应,具有较高的特异性.比较试验证明其敏感性显著高于韩国进口试纸条.在上述试验条件下生产了一批胶体金试纸条进行临床样品检测,并与细菌分离培养、结核菌素皮内变态反应(TST)和韩国试纸条比较.本试纸条与牛分支杆菌分离培养的符合率为85%,与TST的符合率为79.73%,与韩国试纸条的符合率为98.75%.快速检测牛结核抗体的免疫层析试纸条具有敏感、特异、简便、快速的特点,适用于对牛结核病进行普查和检疫,也可作为TST的辅助诊断方法,在牛结核病根除计划中具有良好的应用前景.     

多倍体中华鲟微卫星亲子鉴定体系的建立

应用荧光引物和自动测序技术,检测了10个自主研发的微卫星分子标记在68个中华鲟(Acipenser sinensis)个体中的遗传多态性。结果表明,10个微卫星标记共检测到124个等位基因,等位基因数为7~22,期望杂合度为0.730 26~0.873 95,Shannon-Wiener多样性指数为1.561 61~2.219 60。基于亲子鉴定排除率不低于0.99的标准,最终确定Asi-75067、Asi-67648、Asi-67123、Asi-73843、Asi-72040、Asi-70421和Asi-56700等7个微卫星标记为中华鲟亲子鉴定的核心体系,其单亲、父权和双亲的累积排除率分别为99.12%、99.95%和99.99%。该微卫星标记组合为中华鲟准确高效经济的亲子鉴定体系建立提供了科学依据。     

中华鲟脑膜败血伊丽莎白菌的分离鉴定及药敏特性研究

为了确定中华鲟养殖基地一尾死亡子二代中华鲟的病原,利用传统病原菌分离方法,从濒死的中华鲟肝脏、脾脏和腹水中均分离到一株优势菌EM,采用16S r DNA基因序列分析、构建系统发育树并结合Biolog微生物自动分析系统进行鉴定,确定菌株EM为脑膜败血伊丽莎白菌。进一步对健康子二代达氏鲟进行人工感染试验确定其致病性;同时通过观察患病子二代中华鲟组织切片分析其病理特征;并对菌株EM进行药敏特性研究以期指导临床用药。结果显示,被感染子二代中华鲟肝脏、脾脏及肾脏组织中铁血黄素沉积、实质性细胞空泡变性,溶血严重。菌株EM人工感染健康子二代达氏鲟,发现其对达氏鲟具有致病性,且从人工感染患病的达氏鲟肝脏中再次分离到相同的病原菌。药物敏感性试验表明,中华鲟脑膜败血伊丽莎白菌对米诺环素、克林霉素、克拉霉素和麦迪霉素4种药物敏感,对四环素、头孢噻肟和头孢西叮3种药物中度敏感,对其余28种药物不敏感,呈多重耐药性。本研究首次发现脑膜败血伊丽莎白菌可感染中华鲟,并对达氏鲟也具有致病性,并初步研究了病原菌的生物学特性、病理特征和药物敏感性,以期为该病的诊断和防治提供理论依据。     

从连续到偶发：中华鲟在葛洲坝下发生小规模自然繁殖

中华鲟(Acipenser sinensis Gray)为国家一级重点保护野生动物,典型的溯河洄游产卵鱼类。历史上,中华鲟在长江上游及金沙江下游产卵,由于葛洲坝修建阻隔了其洄游通道,1981年以后在葛洲坝下形成了比较稳定的产卵场,1982―2013年,每年均有自然繁殖发生。由于其栖息生境退化,每年洄游进入长江的中华鲟繁殖亲本逐年减少,2013―2015年连续3年在已知葛洲坝下中华鲟产卵场未监测到中华鲟自然繁殖活动。2016年11―12月的野外监测发现,中华鲟在宜昌葛洲坝下已知产卵场发生了自然繁殖。其中底层网具采集到中华鲟鱼卵(卵膜)67粒、仔鱼22尾;解剖食卵鱼发现,10尾食卵鱼类共摄食中华鲟卵454粒;水下视频观测到5处中华鲟卵黏附底质位点。根据采集到的鱼卵发育期及采集位点推算,产卵时间为2016年11月24日凌晨,产卵场位于葛洲坝大江电厂以下约300 m的江段内,产卵日水温为19.7℃,流量为6610 m3/s,水位为39.7 m。