荧光定量RT-PCR技术快速检测SARS病毒核酸

建立以特异性荧光探针为特点的TaqMan荧光定量RTPCR方法用于检测严重急性呼吸道综合症病毒(severeacuterespiratorysyndromeassociatecoronavirus,SARSCoV)核酸。筛选针对SARS病毒基因保守区域设计的引物与TaqMan探针,并对荧光定量RTPCR反应体系与反应条件进行优化,验证本方法的特异性、敏感度与重复性。实验结果表明:本方法对SARS病毒核酸的检测具有高度特异性,与甲1型、甲3型、乙型流感病毒、禽流感病毒H5N1、麻疹及其他呼吸道病毒均无交叉反应;检测灵敏度达0.1TCID50;从病毒核酸提取至检测完成仅需3h左右,且操作简便,重复性好。本研究建立的TaqMan荧光定量RTPCR方法特异、敏感、快速,适合于临床实验室进行SARS病毒的早期快速检测。     

TaqMan—MGB荧光定量RT-PCR技术快速检测H5亚型禽流感病毒

建立以TaqMan-MGB荧光探针为特点的荧光定量RT-PCR方法,用于检测H5亚型禽流感病毒。针对H5亚型禽流感病毒血凝素(HA)基因保守区域设计特异性引物与TaqMan-MGB荧光探针,筛选并优化荧光定量RT-PCR反应体系与反应条件,用以提高方法的特异性、敏感性与准确性;并通过体外克隆技术建立病毒基因拷贝数进行定量分析。结果表明:引物与探针的优化浓度分别640nmol/L和480nmol/L,体系具有良好的保守性和特异性,与其他呼吸道病毒均无交叉反应。方法检测灵敏度为100拷贝/反应,标准曲线线性范围为107～102拷贝/反应,从病毒核酸提取至检测完成仅需3h左右,操作简便,重现性好。本研究建立的TaqMan-MGB荧光定量PCR方法特异、敏感、快速,适合于临床实验室进行H5亚型禽流感病毒的快速定量检测。     

水稻胞质FBA基因在鱼腥藻7120中的表达及其对光合作用的调控

光合作用包括了一系列复杂的反应,其中碳固定反应是光合作用调控的核心环节。果糖-1,6-二磷酸醛缩酶(FBA)是Calvin循环中固定CO₂后第一个催化三碳化合物转变为六碳化合物的酶,在光合作用中有着重要的作用。近年来,反义技术进一步地证明了FBA在加速碳固定反应方面有着非常大的潜力。本论文通过过表达技术来研究提高FBA活性是否能加速碳固定反应。将水稻胞质FBA嵌合基因转入鱼腥藻7120,通过相应的抗生素筛选及PCR鉴定后,确定得到了稳定遗传的转基因藻。对转基因藻和野生藻进行FBA活性及生理活性的测定后发现：转基因藻中FBA的活性比野生藻提高了31.2%;细胞生长速率比野生藻提高了24.4%;净光合与真实光合分别比野生藻提高了19.2% 和20.6%。以上结果证明,在鱼腥藻体内特异的提高非调控酶FBA的水平,能在一定程度上提高转基因藻的光合活性,并且能够提高转基因藻的细胞增长效率。为进一步研究FBA在光合碳流量中的调控机理提供实验依据。     

浙江省SARS冠状病毒分离与系统进化树分析

从浙江省3例SARS患者中收集含漱液标本,经处理后接种Vero、RD、VeroE6和Hep-2细胞进行病毒分离,培养3d后在Vero和RD细胞中可观察到细胞病变。从细胞培养上清中提取病毒核酸,用SARS冠状病毒特异性引物进行RT-PCR,并经测序证实从3份临床样本中分离到2株SARS冠状病毒株。对其中1株病毒的基因组进行了全序列测定并作系统进化树分析显示浙汀省SARS冠状病毒株与新加坡2774株和台湾TW1株最为接近。     

我国麻疹病毒流行株的H和N基因变异速率探讨

从GenBank检索并下载了我国近40年的麻疹病毒血凝素蛋白(H)和核蛋白(N)的全基因组序列, 用Bioedit7.0软件对参考株和代表株进行序列比对,并进行氨基酸进化树的构建,进一步从氨基酸层面分析麻疹流行株的变化速率.结果显示麻疹病毒H蛋白发生的变异, 表现为近十年的变异率(1.33×10-3)大约为前三十年变异率(0.95×10-3)的1.4倍,而N蛋白发生的变异,表现为近些年的变异率(1.90×10-3)大约为前三十年变异率(1.01×10-3)的1.8倍.本研究结果提示麻疹病毒近年变异率有增快的趋势,今后需加强对麻疹病毒基因型变异和演变的监测.     

浙江省SARS冠状病毒分离与系统进化树分析

从浙江省3例SARS患者中收集含漱液标本,经处理后接种Vero、RD、VeroE6和Hep-2细胞进行病毒分离,培养3d后在Vero和RD细胞中可观察到细胞病变.从细胞培养上清中提取病毒核酸,用SARS冠状病毒特异性引物进行RT-PCR,并经测序证实从3份临床样本中分离到2株SARS冠状病毒株.对其中1株病毒的基因组进行了全序列测定并作系统进化树分析显示浙江省SARS冠状病毒株与新加坡2774株和台湾TW1株最为接近.     

浙江省麻疹病毒分离株的基因特性与免疫原性研究

为了研究浙江省1999～2003年麻疹病毒分离株的抗原性变化以及基因特性,阐明其基因特性与麻疹流行的关系,以及抗原性变化对疫苗免疫效果的影响。我们从麻疹患者含漱液中分离麻疹病毒株,制备大鼠免疫血清,与疫苗株沪191和Edmonston株等进行交叉中和试验,测定各毒株之间抗原比;并采集儿童麻疹疫苗免疫前后血清,分别测定其对不同毒株的中和抗体滴度;采用RT-PCR法扩增麻疹毒株血凝素蛋白(H)及核蛋白(N)基因,进行核苷酸序列测定。结果浙江99-1和浙江02-2株与沪191株之间的抗原比分别为3.0和7.3;儿童免疫后血清对浙江02-2株的麻疹中和抗体平均几何滴度(GMT)为15.03,明显低于沪191疫苗株(GMT为68.12);浙江省1999～2003年麻疹分离株之间,H基因氨基酸同源性为99.8%,N基因氨基酸同源性为98.5%～100.0%;与沪191疫苗株的H基因和N基因相比较,分离株与其在氨基酸水平上同源性分别为95.5%～95.7%和95.9%～96.3%。从基因进化树显示,1999～2003年浙江省分离到的麻疹毒株属于H1基因型,但与疫苗株沪191在抗原性和基因特性上已存在明显的差异。     

非培养法研究成年CF患者长期呼吸道菌群的变化特点

目的研究成年肺囊性纤维化(cystic fibrosis,CF)患者1年内呼吸道菌群的变化特点。方法收集9例已确诊的CF患者痰液标本,平均每月1次,共1年,同时记录患者一般临床状态。对痰液标本分别进行传统细菌培养和16S rRNA测序确定样本中的菌种。根据基因测序确定的菌种结果分析患者1年内呼吸道菌群的变化特点,及其可能与患者的临床状态间的关系。结果通过非培养方法检测到的菌种和临床状态之间无显著相关性。研究初期发现的菌种数量和后续新菌种的获得率之间没有显著关系(所有患者的成对皮尔森相关,P=0.631,r2=0.5)。反Bray-Curtis相似性指数评估在12月内群落组成的总体变化,CF患者之间细菌菌群的变化是不同的,每个患者菌群平均丰度与其时间的变化间无相关性(皮尔森相关P=0.252,R=0.389)。采用DDR检测样本间的相似性是否完全由于样本收集间的时间间隔造成,结果显示1个受试者的距离衰减关系差异有统计学意义(患者5,P=0.041),其他受试者的结果两个采样点的菌落组成与采样的时间间隔没有显著关系,这表明上述观察到的菌落稳定性并非是一个简单的采样频率函数。结论成年CF患者的呼吸道菌群尽管彼此有差异,但各自的长期定植菌群构成相对稳定,不易受呼吸道感染和抗生素应用的影响。     

SchatzkerⅡ型胫骨平台骨折患者CT骨性影像学参数与外侧半月板损伤、术后膝关节功能的相关性分析

摘要 目的：分析SchatzkerⅡ型胫骨平台骨折患者CT骨性影像学参数与外侧半月板损伤、术后膝关节功能的相关性。方法：选择西安交通大学附属红会医院自2020年1月至2022年12月接诊的106例SchatzkerⅡ型胫骨平台骨折患者作研究对象,根据是否发生外侧半月板损伤,分为半月板损伤组和半月板正常组。所有患者均进行CT检查,检测骨性影像学参数[胫骨外侧平台塌陷值(LPD)、胫骨外侧平台增宽值(LPW)],比较损伤组与非损伤组的LPD、LPW,通过受试者工作特征曲线(ROC)分析LPD、LPW预测外侧半月板损伤的效能,使用Pearson相关性分析LPD、LPW与术后膝关节HSS评分的关系。结果：半月板损伤组LPD、LPW均大于半月板正常组（P<0.05）;经ROC曲线分析,LPD、LPW预测SchatzkerⅡ型胫骨平台骨折患者存在外侧半月板损伤的最佳截断值分别为14.13 mm、8.67 mm,AUC分别为0.655、0.750,两者联合预测的AUC为0.925;LPD＜14.13 mm组膝关节功能评价优良等级分布优于LPD≥14.13 mm组（P<0.05）;LPW＜8.67 mm组膝关节功能评价优良等级分布优于LPW≥8.67 mm组（P<0.05）;经Pearson相关性分析,SchatzkerⅡ型胫骨平台骨折患者LPD、LPW与术后膝关节HSS评分均呈负相关（P<0.05）。结论：在SchatzkerⅡ型胫骨平台骨折患者的CT骨性影像学参数检测中,LPD联合LPW预测外侧半月板损伤的效能较好,且两者均与术后膝关节功能的关系密切,值得进一步研究应用。     

中国6省2005年麻疹病毒分离株分子特征分析

研究2005年我国6省麻疹暴发、流行的野毒株基因型特征和分子流行病学,为进一步的麻疹防治策略提供科学依据.用RT-PCR方法,从2005年6省分离的48株麻疹病毒株中扩增出核蛋白（nucleoprotein, N）基因C末端676个核苷酸片段.再对扩增产物进行核苷酸序列测定和分析,并以C末端456个核苷酸片段构建基因亲缘性关系树,进行核苷酸、氨基酸同源性分析.6省分离的48株麻疹病毒均为H1基因型,其中两株为H1b亚型, 其余为H1a亚型.48株野毒株的核苷酸同源性为95.1%～100%（核苷酸差异为0～22bp）,氨基酸同源性为92.7%～100%;与我国疫苗株S191的核苷酸同源性为88.7%～92.5%,氨基酸同源性为88.0%～91.2%.其中Shaanxi05-1和Yunnan05-1,Anhui05-2和Ningxia05-9的N末端456个核苷酸的同源性为100%;Hebei05-19、Anhui00-2和Liaoning02-2,Hebei05-1和Chongqing04-3的核苷酸的同源性为100%.引起2005年我国6省麻疹暴发流行的野毒株为H1基因型,并以H1a为绝对优势亚型.各省之间存在相同毒株引起的传播链,不同年份之间存在相同麻疹野毒株的持续循环传播.同时提示,有必要进一步研究由核苷酸变异引起的氨基酸变异及中和抗原位点等生物学性状的改变,可能影响麻疹病毒的毒力和传播力.