转基因棉花高效定植方法的研究

通过根癌土壤杆菌介导法将外源抗虫基因导入4个陆地棉(GossypiumhirsutumL.)栽培品种。对转基因再生植株的移栽和嫁接研究发现,不同的定植方法对成活率和植株生长状态有显著的影响。直接移栽法、蛭石炼苗法和水培法的定植成活率均较低,缓苗时间也相对较长。而嫁接能够极大地提高再生植株的定植成活率并有效地缩短了缓苗时间,从而克服了棉花再生植株不易定植成活的困难,为基因工程乃至其他生物技术能够顺利地应用于棉花遗传改良奠定了基础。     

陆地棉萌发至三叶期不同生育阶段耐盐特性

摘要：土壤盐渍化是一个世界性的资源问题和生态问题,盐分胁迫几乎会影响棉花所有重要的生命活动, 造成棉花的减产或其他不利影响。本试验通过对14个品棉花种（系）的萌发期耐盐性、芽期耐盐性以及两个耐盐性不同的品种（系）三叶期的耐盐性,对棉花不同时期的耐盐特性进行了研究,结果表明：棉花在不同生育阶段耐盐能力是不同的,棉花盐敏感时间是在萌发出苗期。随着生育期的延长,棉花的耐盐性是逐步提高的,进行耐盐性鉴定的最佳时期在是萌发出苗期。在三叶期,随着盐分浓度的提高,棉花苗受伤害程度逐渐增加,盐敏感性品种受伤害大于耐盐品种,在同样盐浓度胁迫条件下,耐盐性不同的品种各部分受到的伤害不同,耐盐品种（系）中棉所35受伤害程度由高到低依次为：真叶>上胚轴>子叶;盐敏感品种（系）Tamcot CAB-CS受伤害程度由高到低依次为：真叶> 子叶>上胚轴。     

基于陆地棉茎尖转录组序列的genic-SSR标记的开发与评价

利用软件MISA和SSR Locator 对陆地棉（Gossypium hirsutum L.）Coker312茎尖转录组测序得到的73515条Unigene序列进行分析,查找到4507个SSR位点,分布于4039条转录本序列中,SSR出现频率为5.5%,非编码区的SSR位点要显著高于编码区（2853/1654）。SSR重复基元中,三核苷酸重复基元占主导地位（51.03%）,且AAG/CTT （20.08%）类型最多;其次是二核苷酸重复基元（28.76%）,主要为AG/CT（55.47%）。利用引物批量设计软件共开发1569对SSR引物,在陆地棉TM-1、海岛棉3-79 (G. barbadense L.)、阿非利加棉(G. herbaceum L.)、雷蒙德氏棉(G. raimondii Ulbrich.)四个棉种中进行初步评价,其中1117对引物能在四个棉种间扩增出稳定的条带,扩增率为71.2%。选择650对能稳定扩增出条带的引物,在涉及5个棉种（增加了亚洲棉（G. arboreum L.））的13份材料中进一步筛选,83对引物能在13份材料中扩增出特异性条带, PIC变幅在0.121～0.648之间,平均值为0.422,其中80对引物能在7份陆地棉材料中扩增出特异性条带,平均PIC值为0.336;挑选5对在本实验室作图亲本鲁棉研22和鲁原343间有明显多态的引物进行连锁分析,其中4对成功连锁到本实验室构建的遗传图谱上。本研究丰富了棉属genic-SSR的数量,为棉属遗传作图、性状关联分析提供了更多引物选择。     

陆海BC_4F_3和BC_4F_(3:4)代换系纤维产量与品质的表型评价

对陆海BC4F3和BC4F3:4代换系群体的纤维产量与品质的表型性状进行初步评价分析,结果表明,群体代换系各性状平均值与轮回亲本中棉所45相近,但群体内部个体间仍存在丰富的遗传变异,其中不乏超越中棉所45的材料。从中筛选20个纤维品质突出单株(株行),2年的上半部平均长度高于30.00 mm,断裂比强度高于31.0 c N/tex,表现较好的一致性和稳定性,为进一步棉花纤维品质育种提供了选择材料。     

陆地棉类谷氧还蛋(GhGRL)基因家族生物信息学分析

谷氧还蛋白(glutaredoxin, GRX)是一类小分子氧化还原蛋白,可以调节蛋白质的氧化还原状态从而维持蛋白质的功能,在生物的生长发育及抗氧化反应中起着重要的作用。类谷氧还蛋白蛋白(glutaredoxin-like, GRL)是新划分的GRX类型,本研究为深入探究GRL基因家族在陆地棉中功能,对GhGRL基因家族进行生物信息学及表达分析。研究结果表明,32个GhGRL基因主要定位于细胞核,它们均具有GRX-GRX-Like保守结构域。GhGRL基因所编码的氨基酸的多重序列比对和保守序列分析发现,该家族成员序列相似性约为31.31%,大部分包含4个保守基序,同时这4个保守基序与保守结构域重叠;根据GhGRL基因的系统进化树可将32个GhGRL基因分为3亚组,基因结构分析发现该家族基因大部分无内含子;染色体定位分析显示GhGRL基因分散在19个染色体上,每条染色体上的GhGRL基因数目有很大的差别;表达谱数据分析表明,大部分GhGRL基因在根、茎、雄蕊、雌蕊、子房、叶片和花等7个组织器官中均有表达,并且有差异。以上结果有利于了解棉花GhGRL基因家族的基本情况,为深入研究该基因家族在生物学功能提供基础。     

陆地棉GhSUMO基因的克隆与黄萎病菌诱导表达分析

SUMO化修饰与植物抗病防御、信号转导和耐旱等有着直接的关系.本文以抑制差减杂交(suppression subtractive hybridization,SSH)技术获得SUMO的EST为信息探针,对棉花EST数据库进行同源搜索和电子克隆,获得了全长为396 bp的SUMO基因编码区cDNA全长,我们将该基因命名为GhSUMO,推测该基因编码95个氨基酸.分别以抗黄萎病陆地棉品种豫棉21号的cDNA和DNA为模板,对该基因进行了PCR扩增验证,测序结果表明,GhSUMO基因序列与电子克隆序列一致,且没有内含子.蛋白序列分析表明,该蛋白具有保守泛素结构域和C端双Gly的断裂/连接位点,以及保守的疏水表面和Ulp1-Smt3互作位点.系统进化分析表明,该蛋白与蓖麻的同源序列表现了最高的相似性,与其它双子叶植物同源序列次之,而与单子叶植物的相似性较低.棉苗接菌后实时定量PCR结果显示,该基因表达量在接黄萎病菌的量48 h后明显上调,96 h达到未接菌对照的5倍以上.GhSUMO基因可受黄萎病菌诱导表达,表明该基因在陆地棉抗黄萎病的机制中可能发挥重要作用.     

陆地棉GhCDPK1基因响应干旱胁迫的功能初探

钙依赖性蛋白激酶(CDPKs)是一类重要的钙信号感受蛋白和响应蛋白,在植物干旱、低温、盐碱等非生物胁迫应答中起着重要的调控作用。为探讨陆地棉GhCDPK1基因在干旱胁迫下所起的作用,该研究利用实时荧光定量PCR技术分析了PEG模拟干旱胁迫下该基因的表达量,发现GhCDPK1基因受干旱胁迫诱导。通过构建植物表达载体pCAMBIA2300-GhCDPK1,采用农杆菌介导的叶盘法转化模式植物烟草,发现干旱胁迫下转基因植株保水能力明显高于野生型植株,叶绿素、脯氨酸、可溶性蛋白含量及POD、SOD活性也高于野生型植株,而丙二醛含量低于野生型植株。研究结果表明,GhCDPK1基因作为正向调控因子响应干旱胁迫诱导,过表达GhCDPK1基因可以使植株积累更多的渗透调节物质、增强抗氧化系统酶的活性和维持细胞膜的稳定性来提高植物抵御外界干旱胁迫的能力。     

基于表型性状的陆地棉种质资源遗传多样性分析

通过田间性状观测、室内考种分析及纤维品质检测,对来自我国各棉区及国外各类型的429份陆地棉优异种质进行连续2年2点15个表型性状的鉴定及综合评价。结果表明:15个表型性状中始节高、单株铃数和果枝始节位的变异系数最大;各性状的平均遗传多样性指数较高为2.02;主成分分析确立了3类影响因子,表明陆地棉品种选育应集中在纤维品质优良(尤其纤维长度和比强度要高)、高衣分和株铃数多的品种;聚类分析将所有材料分为10个类群,其中第Ⅰ类群占供试材料总数的76.9%,各类群间性状差异明显,聚类结果与材料的地理来源之间没有直接的关系。     

过表达或沉默棉花GhPCBER基因株系的获得及其茎叶木质素和木脂素含量研究

编码苯基香豆满苄基醚还原酶(phenylcoumaran benzylic ether reductase,PCBER)的基因PCBER属于PIP亚家族,是苯丙烷代谢途径中参与木脂素合成的关键基因。该研究构建了棉花GhPCBER基因的植物过表达载体并转化拟南芥,同时构建了VIGS(virus induced gene silencing,病毒诱导的基因沉默)载体转化棉花,采用实时荧光定量PCR技术对GhPCBER基因在不同组织中的表达进行分析;对野生型和转基因植株茎叶组织中的木质素和木脂素含量进行测定分析。结果表明:(1)成功构建了GhPCBER植物过表达载体pGWB17-GhPCBRE以及基因沉默重组载体pTRV2-GhPCBER;经遗传转化获得6株转棉花GhPCBER基因抗性拟南芥植株,同时获得15株GhPCBER基因沉默棉花植株(5株为一组)。(2)PCR检测表明,6株转基因拟南芥均为过表达株系,其中株系1、2、3相对表达量更高,且在茎、叶组织中的表达量分别较野生型提高了7～14倍和6～16倍,表明GhPCBER基因成功在拟南芥中过表达;GhPCBER基因沉默棉花植株的茎、叶组织中的表达量分别比野生型棉株约下降12%和26%,表明烟草脆裂病毒(TRV)体系(pTRV2-GhPCBER)成功抑制了GhPCBER基因的表达。(3)转GhPCBER基因拟南芥茎、叶中木质素和木脂素含量较野生型均显著降低;GhPCBER基因沉默棉花植株茎、叶中木质素和木脂素含量较野生型均极显著降低;组织化学染色观察发现GhPCBER基因沉默棉花植株茎秆颜色明显比野生型染色浅,也证明沉默基因棉花植株茎秆中的木质素含量减少。(4)苯丙烷代谢通路中8个相关基因的实时荧光定量PCR分析发现,过表达或抑制GhPCBRE基因均会导致苯丙烷代谢途径发生重新定向。     

棉花体细胞胚发生机理的研究进展

棉花是一种较难通过体细胞胚发生完成植株再生的作物,而体细胞胚发生是限制棉花基因工程和细胞工程得以广泛应用的主要因素.研究者从不同角度探讨了棉花体细胞胚发生机理并取得了很大的进展,为棉花的遗传转化提供了重要的技术支持,同时成功建立了一些棉花植株再生体系.本文分别从基因型限制、胚胎学、生理生化变化、分子机理等方面阐述了近年来棉花体细胞发生机制的研究进展,并讨论了本研究领域目前存在的主要问题及相应对策.