对乳杆菌DM8909菌株质粒的检测

德氏乳杆菌乳酸变种（ＬａｃｔｏｂａｃｉｌｕｓｄｅｂｒｕｅｃｋｉＳｕｐｓｐ．ｌａｃｔｉｓ）是阴道正常菌群成员之一,探讨该菌株是否存在质粒对于研究乳杆菌耐药性具有一定意义。现将ＤＭ８９０９质粒检测情况报告如下。１材料与方法１１菌株与培养基菌株德氏乳杆...     

天花粉蛋白Y14F/R22L定点突变及其活性研究

利用多聚酶链式反应（ＰＣＲ）技术,对天然天花粉蛋白（ｎＴＣＳ）基因在Ｔｙｒ１４和Ａｒｇ２２两个保守残基处同时进行定点突变,即Ｔｙｒ１４变成Ｐｈｅ,Ａｒｇ２２变成Ｌｅｕ,然后克隆到ｐＥＴ－８ｃ高效表达载体上,构建成重组质粒ｐＥＴＹ１４Ｆ／Ｒ２２Ｌ．经序列分析,定点突变的结果与预先设计的完全一致,突变后的天花粉蛋白命名为Ｙ１４Ｆ／Ｒ２２ＬＴＣＳ．将ｐＥＴＹ１４Ｆ／Ｒ２２Ｌ转化到Ｅ．ｃｏｌｉＢＬ２１（ＤＥ３,ｐＬｙｓＳ）中,进行表达．经ＣＭ－ＳｅｐｈａｒｏｓｅＣＬ－６Ｂ柱纯化,ＳＤＳ－ＰＡＧＥ鉴定,纯度可达９０％．ＲＩＰ活性测定显示,Ｙ１４Ｆ／Ｒ２２ＬＴＣＳ的活性比ｎＴＣＳ降低了７．５倍,活性变化不显著,因此,ＴＣＳ的Ｔｒｙ１４和Ａｒｇ２２对维持其活性部位构象并不是必需的．但由于Ｙ１４Ｆ／Ｒ２２ＬＴＣＳ在Ｅ．ｃｏｌｉ中的表达量与ｎＴＣＳ相比明显下降,因此,Ｔｙｒ１４和Ａｒｇ２２可能与ＴＣＳ翻译后的折叠有关．     

哺乳类细胞基因表达系统

真核基因的转录和转译调控是哺乳类细胞基因表达系统建立和发展的基础,外源基因的表达水平不仅决定于启动子/增强子的强弱,还与剪接信号、终止信号和poly(A)信号以及质粒的拷贝数等因素有关。另外,在基因治疗的研究中,也已寻找到多种具有组织或肿瘤特异性的启动子,来达到特异性肿瘤基因治疗的目的。     

磷酸钙法对哺乳动物非贴壁细胞的质粒共转染

对一种哺乳动物的非贴壁细胞Bal b/c近交系小鼠肥大细胞瘤细胞株P815进行了G418敏感浓度及甘油耐受性的测定;并通过磷酸钙法用含HBVS基因的质粒pRc/CMVS与含筛选标记基因neo的质粒pSV_2-neo进行了共转染。经G418筛选,获得了G418抗性细胞P851-S,在G418选择压力下,已连续筛选80余天,传代12次;斑点杂交和ELISA实验分别表明P815-S细胞内有HBVS基因的存在,培养上清中有HBsAg的表达。     

在大肠杆菌中表达酮酸脱羧酶产异戊醇

酮酸脱羧酶作为异戊醇生物合成的关键酶,不存在于大肠杆菌中。以乳酸乳球菌的基因组DNA为模板,经过PCR扩增得到酮酸脱羧酶基因kivD(rbs),插入到大肠杆菌高效表达载体pET-28a(+)上形成pET-kivD(rbs),重组质粒热击转化进大肠杆菌BL21(DE3)中,其成功表达了酮酸脱羧酶。对发酵产物进行分析,检测到了微量的目标产物—异戊醇。     

Ri质粒介导的毛状根体系建立及其在植物次生代谢产物合成中的研究进展

发根农杆菌Ri质粒可诱导植物产生毛状根体系,该体系具有遗传性状稳定且增殖速度快的特点,可用于药用植物次生代谢产物的生产研究,为利用生物反应器技术进行药用植物有效成分工业化水平的发酵培养开辟了新途径。本文主要综述了发根农杆菌Ri质粒介导的植物毛状根体系遗传转化机理,并对毛状根体系在药用植物次生代谢产物生产中的研究现状进行了深入分析,为从基因水平上调控植物次生代谢产物的合成提供新思路。     

一株抗锰土壤芽胞杆菌的分离鉴定与生物学活性分析

从山东崅屿采集的黄棕壤中分离得到一株具有抗Mn(Ⅱ)和Mn(Ⅱ)氧化双重活性的芽胞杆菌,其最高Mn(Ⅱ)耐受浓度达到130mmol/L,对Mn(Ⅱ)的氧化活性为3.3μmol/(L·d)。通过个体形态与培养特征观测、生理生化反应、G+Cmol%测定和16SrDNA序列比对分析等鉴定,确定该菌株为巨大芽胞杆菌(Bacillus megaterium),命名为MB283。该菌株在添加Mn(Ⅱ)(10mmol/L)条件下比不添加Mn(Ⅱ)表现出相对较快的生长速率。采用高温培养并结合0.01%SDS处理,从MB283菌株筛选到一株发生内生质粒消除的突变株MB287,具有与野生菌株类似的锰耐受活性,且对Mn(Ⅱ)的氧化活性与野生菌株相比无明显改变,表明野生菌株MB283中与锰抗性和锰氧化相关的基因可能是定位于该菌的染色体上。     

高温链霉菌质粒pTSC2的测序分析和滚环复制方式的鉴定

从猪粪堆肥中分离到一株编号为X3-3的可以在50℃高温生长的链霉菌菌株,该菌株含有一个约7kb的环型质粒pTSC2。【目的】克隆、测序和分析pTSC2,以及鉴定质粒的复制方式。【方法】利用分段克隆和引物延伸获得pTSC2的全序列,利用多序列比对寻找复制元件rep、dso和sso,利用中性转移和Southern杂交检测复制中间体。【结果】克隆和测序获得了全长为7516bp的pTSC2序列,预测编码8种蛋白,其中4种蛋白与链霉菌滚环复制的质粒pIJ101中负责复制和接合转移的蛋白非常相似。pTSC2的复制元件rep、dso和sso也与pIJ101的相似。克隆、转化变铅青链霉菌ZX7以及高温链霉菌2C证明了rep和dso为复制所必需元件。Southern杂交检测到pTSC2复制过程中积累了大量的单链DNA。【结论】高温链霉菌质粒pTSC2以滚环方式进行复制。这是首次在高温链霉菌中克隆和测序质粒,以及鉴定其复制方式。     

短双链RNA在病毒性心肌炎小鼠模型中的抗病毒研究

目的:通过在小鼠病毒性心肌炎动物模型研究短双链小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)对病毒感染和复制的抑制作用,研究RNAi在治疗病毒性疾病的可行性.方法:利用质粒载体将siRNA转染至HeLa细胞和Balb-c小鼠后感染病毒,荧光显微镜现察GFP表达量观察细胞内质粒转染效率和持续时间,通过病毒致细胞病变作用(CPE)保护实验病毒空斑形成实验检测病毒受抑制程度,动物模型中观察动物死亡率和易感组织病理变化评价siRNA的保护作用.结果:在HeLa细胞中针对CVB3 2B区的siRNA能显著抑制柯萨奇病毒B3的感染和复制,抑制率可达90%.动物模型中sigNA质粒可改善动物存活率(30%),并降低易感脏器中病毒含量,减轻病理反应.结论:针对CVB3基因组2B区的siRNA在病毒性心肌炎动物模型中具有保护作用.     

幽门螺杆菌STM文库重组质粒的构建

目的:应用信号标签突变技术(Signature tagged mutagenesis,STM)构建幽门螺杆菌突变体文库重组质粒。方法:采用平末端内切酶随机酶切幽门螺杆菌基因组DNA,并回收300～500bp片段(记作Fr),基因重组技术构建重组质粒pID700-Fr,电转化E.coliDH5α筛选阳性克隆,提取重组质粒酶切鉴定。结果:成功构建了1200个幽门螺杆菌STM文库重组质粒。结论:STM技术可用于幽门螺杆菌致病以及耐药相关基因的筛选,为幽门螺杆菌致病及耐药机理的研究奠定了基础。也将为幽门螺杆菌的治疗提供新的药物靶点。