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61.
摘要:【目的】研究质粒介导喹诺酮类药物耐药基因qnrS在一养殖场中的流行特点。【方法】分离养殖场不同来源样品中的大肠杆菌菌株,利用美国临床标准委员会(CLSI)推荐的药敏纸片法测定菌株耐药情况,通过质粒接合试验获得qnrS阳性接合子,测定qnrS对喹诺酮类药物最小抑菌浓度(MIC)值的影响及其与其它类抗生素耐药性的相关性,利用脉冲场凝胶电泳分析该场中qnrS阳性菌株遗传进化关系。【结果】环境源菌株qnrS的阳性率为29.2%,显著高于禽源菌株基因检出率(13.4%),新进的雏鸡可迅速从养殖场中获得
qnrS基因并在鸡群中流行。qnrS基因可使接合子对喹诺酮类药物MIC值不同程度升高,并且与其它五类抗生素具有相关性,不同qnrS阳性菌株间遗传关系较远,但也存在同一克隆株的流行。【讨论】qnrS基因主要通过质粒的播散等进行水平传播,同时也存在同一克隆株的流行传播。qnrS基因多样性及其水平传播方式造成了它的广泛流行,加强对耐药基因的监测及研究对减少多重耐药菌株的产生具有重要意义。 相似文献
62.
为建立多顺反子质粒载体转染技术获得人脂肪干细胞(adipose stem cells,ASCs)来源的诱导多能干细胞(induced pluripotency stem cells,iPSCs),应用2A元件连接Oct4/Sox2/KLF4/c-Myc四因子基因,构建为单一开放阅读框的多顺反子质粒载体.使用该质粒对ASCs进行转染及重编程为iPSC.采用形态学观察、特异性抗体免疫荧光鉴定、体外拟胚体诱导分化和体内畸胎瘤形成等方法进行鉴定.结果显示,ASCs成功重编程为iPSCs,具有与人胚胎干细胞相似的形态学及多向分化潜能;通过拟胚体和畸胎瘤实验证实iPSCs能在体内外分化成三胚层细胞;DNA印迹实验显示质粒载体序列未整合至iPSCs基因组中.因此,通过多顺反子质粒载体重编程技术成功建立的人iPSCs具有多向分化潜能,可减免发生插入突变和免疫排斥问题,为iPSCs在遗传性或退行性疾病的治疗奠定了实验基础. 相似文献
63.
目的:本实验利用基因重组技术,构建融合Th细胞TT830-844表位序列的人重组Myostatin基因疫苗真核表达载体pVAC-TT-Ms,检测该基因疫苗对免疫小鼠前肢抓力的影响,为后续以Myostatin作为靶分子来改善废用性肌肉萎缩等病症的研究提供实验基础。方法:化学耦联方法合成Myostatin C-末端成熟肽(330 bp)基因序列及其N-端融合TT表位序列的DNA片段,重组质粒pVAC-TT-Ms的构建、纯化及瞬时转染中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)按该类研究中的常规实验操作,并检测重组基因疫苗pVAC-TT-Ms免疫小鼠骨骼肌前肢抓力的变化。结果:酶切和测序结果表明,重组Myostatin基因疫苗表达载体pVAC-TT-Ms构建成功。重组质粒pVAC-TT-Ms OD260/280比值和电泳结果显示,该质粒作为基因疫苗符合免疫动物的质量要求。细胞荧光免疫检测结果表明,瞬时转染的CHO细胞中目的蛋白明显表达。动物免疫实验初步证明,重组Myostatin基因疫苗可显著提高免疫小鼠的前肢抓力,与正常对照组比较,免疫小鼠前肢抓力平均增加了29.88%。结论:本实验成功构建了在真核细胞中能有效表达融合TT表位序列人重组Myostatin基因疫苗表达载体,初步证明了重组Myostatin基因疫苗可显著增加免疫小鼠前肢抓力。 相似文献
64.
65.
目的:将Bcr-Abl及Bcr-Abl T3151突变克隆入pcDNA3.1(-)真核表达载体,为研究靶向降解受体型酪氨酸激酶BCR-Abl,抑制肿瘤细胞生长提供研究基础.方法:pcDNA3.1 (-)-Bcr-Abl质粒构建:分别设计引物,通过分段PCR将BCR-ABL克隆入pcDNA3.1(-).首先通过PCR扩增出Bcr-a片段,将其克隆入pcDNA3.1(-)的NheⅠ/XhoⅠ之间;接着将PCR扩增出的Abl-c片段克隆入KpnⅠ/ HindⅢ之间,最后XhoⅠ/KpnⅠ双酶切pGD210,将酶切下片段插入pcDNA3.1(-)的相应位点即可.酶切鉴定及测序正确后,转染293T细胞,Western blot验证质粒的表达.pcDNA 3.1(-)-Bcr-Abl T3151的突变质粒:首先设计引物,第一步以pcDNA3.1(-)-BCR/ABL为模板,以Abl-c-u和ba-M1为引物扩增出A-1:560 bp.第二步,相同模板,以ba-M2和ba-M-down为引物扩增出A-2:870 bp.第三步,以扩增出的A-1和A-2为模板,以Abl-c-u和ba-M-down为引物,扩增出1434 bp的片段A-l+2,以Bcl和Kpn Ⅰ分别酶切pcDNA3.1 (-)-BCR/ABL以及A-1+2,将突变后的A-l+2置换入pcDNA3.1 (-)-BCR/ABL.结果:PCR结果显示3.1(-)-Bcr-Abl及3.1 (-)-Bcr-Abl T3151突变质粒条带大小符合,重组质粒经酶切鉴定和测序结果正确,转染后可见融合蛋白的表达.结论:成功构建pcDNA3.1 (-)-Bcr-Abl及pcDNA 3.1(-)-Bcr-Abl T3151的真核表达载体,并且转染293T细胞后证实其能够正确表达,为后续研究奠定了基础. 相似文献
66.
定向进化的突变体库建立是定向进化是否成功的关键因素,只有建立足够大的库容才有可能筛选到合适的突变体。然而用来做定向进化的宿主菌的转化效率并不总是那么高,难以达到建库要求。而且在以常规分子克隆方法做连接转化时,耗时长,效率低等问题也影响了突变体库的建立,高效的克隆转化方法是定向进化所需求的。本文以大肠杆菌BL21(DE3)为转化宿主菌,挑选了一种新的高效的克隆转化方法,与现在实验室常规克隆转化方法进行了比较,证明了PCR多聚质粒的克隆转化方法在定向进化突变体库构建中的优势。为定向进化突变体库的构建提供了新的高效可靠的技术方法。 相似文献
67.
目的:构建基于CRISPR/cas9系统调控Wnt信号通路的载体,并在细胞水平验证其调控基因表达的效率。方法:选取Wnt信号中负性调控分子,设计并合成能够表达靶向上述分子gRNA的互补DNA克隆序列,BsmBI限制性内切酶酶切载体后,采用分子克隆的方法将上述序列克隆至目的载体lenti-sgRNA-Ms2-zeo,测序正确的克隆通过Lipofectamine2000与lenti-Ms2-P65-HSF1-Hygro和lenti-dcas9-VP64-blastine共同转染入293细胞;转染24h后收集细胞,qRt-PCR检测目的基因的表达。结果:筛选了Wnt信号通路中已知的19个负性调控基因;针对每个基因设计了两对gRNA序列,并构建了能够表达gRNA和MS2融合序列的载体,测序结果显示重组质粒的DNA序列与预期完全相符。随机挑选了4个表达载体与lenti-Ms2-P65-HSF1-Hygro和lenti-dcas9-VP64-blastine共转进入细胞,qPCR结果显示构建的目的载体联合lenti-Ms2-P65-HSF1-Hygro和lenti-dcas9-VP64-blastine载体可以协同促进靶分子表达。结论:本研究成功构建了基于CRISPR/cas9基因编辑系统调控Wnt信号的载体。 相似文献
68.
目的:将携带Livin的质粒pIRES2-EGFP-Livin进行扩增,转染自然杀伤细胞(NK)及胃癌细胞株SGC-7901,并检测其在NK及胃癌细胞株SGC-7901中的表达。方法:将携带Livin基因的质粒p IRES2-EGFP-Livin进行扩增,鉴定质粒纯度与浓度;从健康人外周血中获得NK细胞,应用HP转染试剂将质粒pIRES2-EGFP-Livin转染体外培养的NK及胃癌细胞,对比分析NK及胃癌细胞株SGC-7901中基因转染效率及目的基因的表达情况。结果:用无血清培养基在体外成功的扩增大量的NK细胞;质粒提取试剂盒抽提得到大量无内毒素的质粒,质粒DNA基因序列并未发生突变,浓度和纯度较高。胃癌细胞株SGC-7901中观察到明显的质粒pIRES2-EGFP-Livin绿色荧光表达;而NK中未观察到绿色荧光表达。结论:质粒pIRES2-EGFP-Livin能使Lvin蛋白表达于胃癌细胞株SGC-7901中,而在NK中未表达。 相似文献
69.
《微生物学免疫学进展》2016,(3)
目的构建pc DNA3.1-EV71-2A的突变质粒(EV71-2Amut),并对其功能进行检测,为进一步研究肠道病毒71型(Enterovirus type 71,EV71)2A蛋白酶的活性位点及其生物学功能奠定实验基础。方法利用聚合酶链式反应(PCR)定点诱变技术,定点突变编码EV71-2A第21His、39Asp和110Cys氨基酸的位点,构建EV71-2Amut,并测序鉴定。将所构建突变质粒与巨细胞病毒(Cytomegalovirus,CMV)启动子介导的真核细胞荧光素酶报告基因(pRL-CMV)共转染人横纹肌肉瘤细胞(RD细胞),通过观察转染组的EV71-2Apro和EV71-2Amut对pRL-CMV荧光强度的影响,判断突变质粒的细胞内酶活性。将EV71-2Apro或EV71-2Amut质粒转染BALB/c小鼠股四头肌,用RT-PCR检测局部相应质粒的mRNA水平,并观察局部肌肉组织的病理变化。结果构建的突变质粒EV71-2Amut经测序及比对,结果与预计突变位点一致;在细胞学水平检测到的pRL-CMV荧光强度,EV71-2Amut组比EV71-2Apro组显著增高(P0.05);小鼠股四头肌注射局部均检出EV71-2Apro和EV71-2Amut的mRNA表达,且与EV71-2Apro组相比,EV71-2Amut注射组的肌肉组织的肌肉凝固性坏死、炎症反应病理损伤较轻。结论成功构建了突变的EV71-2Amut质粒,为研究EV71-2A蛋白酶的生物学功能奠定了实验基础。 相似文献
70.
为比较研究不同质粒针对不同乳酸茵的电转效率的差异,分别以乳酸乳球菌NZ9000、干酪乳杆菌LC2W和植物乳杆菌WCFS1三种乳酸菌为受体,以七种不同质粒为载体,进行电转实验.结果表明在乳酸乳球菌NZ9000中,转化效率最高的是pIB 184质粒,达到了1.53×107 cfg/μgDNA,在干酪乳杆菌LC2W中,pSIP403质粒的电转化效率最高,达到了6.42×105 cfg/μgDNA,在植物乳杆菌WCFS1的电转化中,是pNZ44质粒达到8.68×105 cfg/μgDNA的最高转化效率.其中质粒pIB184和pNZ44在三种菌株中均有较高的电转化效率,超过了103 cfg/μgDNA,另一方面T-pAMS100、pSIP403、pSIP409三个质粒在干酪乳杆菌与植物乳杆菌中的电转化效率明显高于乳酸乳球菌.不同质粒针对不同乳酸茵的转化效率为乳酸茵的高效电转和表达栽体的选择与构建提供了可行依据. 相似文献