大兴安岭产胎生蜥蜴的染色体组型研究

本文采用骨髓细胞制片法,对分布在黑龙江省大兴安岭地区呼玛县的胎生蜥蜴(Lacerta vivipara)染色体组型进行了研究。结果表明,雄性胎生蜥蜴的二倍体染色体数是36,性染色体为ZZ型,2n=34+ZZ;雌性胎生蜥蜴的二倍体染色体数是35,性染色体为W型,2n=34+W,胎生蜥蜴的性别决定机制为ZZ/W型,其染色体全部为顶端着丝点染色体(除雌性的性染色体为中部着丝点染色体外)。     

核酸探针斑点杂交检测对虾传染性肌肉坏死病毒

通过PCR方法制备了对虾传染性肌肉坏死病毒地高辛标记探针,探针长度123 bp,通过核酸探针斑点杂交检测方法对此探针特异性及灵敏度进行验证.结果表明,该方法检测对虾传染性肌肉坏死病毒cDNA的检出灵敏度为108拷贝,可检出1拷贝的传染性肌肉坏死病毒cDNA的PCR产物.本方法可应用于健康亲虾、苗种的培育和无特定病原(SPF)对虾种群的选育及传染性肌肉坏死病毒流行病学调查,具有较高的应用价值.     

麦长管蚜OBP7基因的RNA干扰

OBP是蚜虫嗅觉功能中的一类重要分泌蛋白,能选择性地结合气味分子并进行信号转导。本试验使用显微注射法将麦长管蚜OBP7的小干扰RNA(siRNA)导入麦长管蚜体内,通过qRT-PCR检测OBP7mRNA相对表达量的变化情况。结果发现在siRNA浓度0.32μg/μL,注射量23nL,注射后24h,麦长管蚜成蚜的mRNA相对表达量降低到37.1%,证明了显微注射方式进行RNA干扰的可行性。在注射23nL的siRNA-467,经过36h后,麦长管蚜出现了对EβF趋性行为的改变(P0.05),表明OBP7蛋白在麦蚜对EβF的识别过程中具有重要作用。     

生物素标记cDNA探针杂交检测梨树上3种潜隐病毒研究

 本研究合成了苹果茎沟病毒(ASGV)、苹果褪绿叶斑病毒(ACLSV)和苹果茎痘病毒(ASPV)的生物素标记cDNA探针,对斑点杂交和免疫印迹杂交检测这3种病毒的效果进行了分析。以含ACLSV和ASGV克隆片段的大肠杆菌菌液为样品时,斑点杂交检测灵敏度分别为80 cfu/μL和50 cfu/μL。以离体培养砂梨植株为材料,采用斑点杂交法检测砂梨离体培养植株粗提液中的3种病毒,均产生强的杂交信号,且特异性好。比较斑点杂交和ELISA检测病毒含量相对较低的热处理再生植株中ASGV和ACLSV,结果表明斑点杂交具有较高的灵敏度。组织印迹杂交检测砂梨离体植株ASGV和ACLSV的结果显示,这2种病毒在离体植株的各部位均有分布,自基部至茎尖各部位印迹均产生很强的杂交信号。     

刺参腐皮综合征病原灿烂弧菌检测探针的制备及应用

腐皮综合征是近年来养殖刺参发生的严重疾病.发病时,刺参大批死亡,经济损失惨重.以其主要致病原灿烂弧菌(Vibrio splendidus)DNA为模板,PCR扩增出16S-23S核糖体RNA基因间隔区序列,插入pMD19-T,转化大肠杆菌DH5α并测序.根据该间隔区序列,设计引物扩增177 bp的地高辛标记的探针.该探针对灿烂弧菌呈现特异性,而对其它细菌V. Fluvialis,V. Anguillarum,V. Alginolyticus,Aeromonas hydrophila,V. Harveyi,V. Parahaemolyticus,V. Vulnificus均呈阴性.探针对灿烂弧菌DNA的检出限为6.25 pg, 具有较高敏感度.用该探针对人工感染以及从青岛、烟台、威海获取的腐皮综合征发病海参和养殖水体进行斑点杂交,灿烂弧菌检出率达100%.结果表明,该探针具有良好的特异性和敏感性,可用于快速检测养殖刺参腐皮综合征的病原灿烂弧菌.用该方法检测刺参腐皮综合征尚属首次,为刺参腐皮综合征的快速诊断和防治提供技术支撑.     

海参DNA条形码的构建及应用

为研究线粒体细胞色素c氧化酶亚基Ⅰ (Mitochondrial cytochrome c oxidase subunit Ⅰ,COⅠ)基因作为DNA条形码鉴定海参品种的可行性,本实验采集了7种海参(Holothuroidea)43个个体并获得其线粒体COⅠ基因序列,利用DNAsar、DNAMAN和MEGA 4.1软件分析计算了7种海参的碱基组成以及不同海参之间的种间遗传距离和种内遗传距离,利用邻接法和最大简约法分别构建了分子系统树.结果表明,海参的种间遗传距离显著大于种内遗传距离,不同海参在系统树中分别形成各自独立的分支,表明以CO Ⅰ作为海参DNA条形码进行品种鉴定具有一定的可行性.在建立海参DNA条形码的基础上,设计了针对仿刺参(Apostichopus japonicas)的特异性探针.对4种海参(仿刺参Apostichopus japonicas、冰岛参Cucumaria frondosa、加州拟刺参Parastichopus californicus及梅花参Thelenota ananas)进行斑点杂交实验,结果显示,该探针具有较好的特性和较高的灵敏度,能够实现对仿刺参的鉴定.本研究为后续开展斑点杂交及基因芯片法鉴定海参种类的研究奠定了理论基础.     

创伤弧菌快速检测法的建立

[目的]针对创伤弧菌(Vibrio vulnificus)采用杂交瘤技术制备单克隆抗体,基于单克隆斑点杂交技术进行改良,建立一种创伤弧菌快速检测方法。[方法]由水产品牡蛎中分离获得一株创伤弧菌FD-1,以其灭活全菌为抗原免疫小鼠,采用杂交瘤技术制备单克隆抗体。在此基础上,对传统斑点杂交技术进行优化改进,以化学发光试剂ECL替代传统TMB底物,进一步提高其灵敏度、缩短检测时间和简化操作步骤。[结果]与传统斑点杂交法相比,改良斑点杂交法的检测时间可缩短至2 h,检测限可达1×10~5CFU/m L。[结论]改良斑点杂交法比传统TMB底物斑点杂交法(1×10~7CFU/m L)灵敏度提高了100倍,操作过程简单,在水产品检验和医疗诊断方面具有良好的开发应用前景。     

核酸杂交技术在禽白血病病毒TCID_(50)测定中的应用

为探索核酸杂交技术在测定J亚群禽白血病病毒(ALV-J)细胞半数感染量(TCID50)中的可行性,将ALV-J传染性克隆r NX0101株以10倍梯度稀释后按常规方法接种已长满单层鸡胚成纤维细胞(CEF)的96孔板,在维持7 d后收集细胞培养上清。上清液部分按照试剂盒说明书进行p27抗原的ELISA检测,另一部分提取RNA后以鸡致病性外源性禽白血病病毒特异性核酸探针交叉斑点杂交检测试剂盒进行Dot-blot检测,每孔中细胞固定后以ALV-J特异性单克隆抗体进行IFA检测,确定病毒感染孔后按照Reed-Muench法分别计算三种方法测定的TCID50。结果显示ELISA法、IFA法和Dot-blot法在确定病毒感染中能够相互验证和补充,该病毒在CEF的TCID50分别为10-4.7TCID50/0.1 m L、10-5.2TCID50/0.1 m L和10-5.3TCID50/0.1 m L。表明采用Dot-blot法测定ALV-J的TCID50是可行的,不仅能够排除内源性的干扰,并且比ELISA和IFA具有更高的灵敏度。     

不同方法对网状内皮组织增殖病病毒的检测

从山东、江苏、上海等地的鸡场中，收集疑为网状内皮组织增殖病病毒（REV）感染鸡的脾脏、肝脏56份，分别通过聚合酶链式反应（PCR）、斑点杂交试验（Dot-blot)和间接免疫荧光试验（IFA）对其进行REV检测。结果有21份呈PCR阳性，20份呈Dot-blot阳性，15份呈IFA阳性，且所有IFA阳性样品，PCR和Dot-blot检测都呈阳性，20份Dot-blot阳性样品中有19份呈PCR阳性。研究表明，PCR检测REV较其他方法敏感，可作为REV的常规检测方法之一。