大肠杆菌调控因子工程及其菌株耐受性研究进展

大肠杆菌具有金字塔式的基因表达等级调控网络,调控因子的自动调控、共调控和交叉调控,构成了复杂而又精细的转录调控网络。微生物通过扰动和优化这个高效的调控网络快速地响应环境变化,而适应新的耐受条件。微生物的耐受性是由多基因控制的复杂表型,通过大肠杆菌调控因子工程,可以大尺度重构调控网络,显著改进菌株耐受性,成为了近几年的研究热点。本文总结了大肠杆菌调控因子及其工程方法,综述了通过大肠杆菌调控因子工程重构代谢网络来提高菌株耐受性的最新研究进展,展望了通过大肠杆菌调控因子工程提高菌株鲁棒性的发展方向。     

人造甜味剂对人体健康的影响

人造甜味剂（artificial sweeteners,AS）是人类利用化学方法制造的一类食品添加剂,它们的甜度高,大 多无热量,无营养价值,目前在食品和饮料等加工过程中应用广泛。然而近年来的研究表明,AS的过量摄入会引 起肠道菌群结构和组成改变,进而导致机体出现葡萄糖耐受性异常及相关代谢系统紊乱的现象,甚至引起肥胖等健 康问题。这些研究成果提示在利用AS时要注意摄入量及连续摄入时间,并为进一步开发和合理利用AS提供一定的 理论依据。     

生物膜形成对植物乳杆菌PG3-1耐受性及功能基因表达的影响

研究了植物乳杆菌PG3-1生物膜形成后对其耐受性以及功能基因表达的影响。采用平板计数及实时荧光定量PCR对其耐受性以及功能基因相对表达量进行测定。结果表明,植物乳杆菌生物膜形成后对温度、酸碱、盐度耐受性均有不同程度的提高。植物乳杆菌生物膜形成过程中发生热应激、酸应激、盐应激等应激行为,Gro EL、Dan K热应激基因的相对表达量达到3.22和1.53。     

5株非酿酒酵母的耐受性及发酵特性研究

以陆生伊萨酵母（Issatchenkia terricola）、浅白隐球酵母（Cryptococcus albidus）、葡萄汁有孢汉逊酵母（Hanseniaspora uvarum）、美极梅奇酵母（Metschnikowia pulcherrima）、戴尔有孢圆酵母（Torulaspora delbruecki）为试材,分析了5株非酿酒酵母的生长特性、耐受性和碳源氮源同化能力及发酵速率。结果表明,戴尔有孢圆酵母的生长量较大,耐受的葡萄糖质量浓度为500 g/L、酒精体积分数为18%、SO2质量分数为420 mg/L,可同化氮源3种、碳源11种;陆生伊萨酵母的生长量较小,耐受的葡萄糖质量浓度为350 g/L、酒精体积分数为6%、SO2质量分数为120 mg/L,可同化氮源4种、碳源10种;其余3株非酿酒酵母的耐受及发酵特性优于陆生伊萨酵母低于戴尔有孢圆酵母;陆生伊萨酵母发酵速率在第2天达到最大值,其余4株酵母均在第3天达到发酵高峰。     

植物乳杆菌NCU116在模拟人体消化环境中的耐受力

模拟人体消化道环境,即在人工胃液、人工肠液、胆盐和高盐环境下对植物乳杆菌NCU116的耐受力进行研究。结果表明：植物乳杆菌NCU116在pH1.5和pH2.5的人工胃液中培养3h,存活率分别达到了32.62%和45.76%,在pH3.5以上的人工胃液中能保持很高的存活率;在人工肠液中作用4h,存活率达到了49.63%;牛胆盐环境中培养24h后的NCU116活菌数随牛胆盐质量浓度(0.03～1.00g/mL)的增加而降低,但活菌数均保持在107CFU/mL以上;NaCl高盐环境中培养24h后的活菌数随NaCl质量浓度(1～8g/100mL)的增加而稍有降低,当NaCl质量浓度为8g/100mL时,活菌数仍在108CFU/mL以上。这表明植物乳杆菌NCU116对人工胃液、人工肠液、胆盐和高盐具有较好的耐受力,在食品和保健品工业中具有良好的应用前景。     

贺兰山东麓葡萄酒产区酿酒酵母的分离及其主要特性研究

为进一步丰富我国酿酒酵母资源,从贺兰山东麓葡萄酒产区的6个不同品种的成熟期酿酒葡萄果实上分离获得9株野生酿酒酵母,以商业酿酒酵母F15为对照,对分离所得菌株分别进行酒精、SO_2、葡萄糖、pH和高渗等耐受性以及β-葡萄糖苷酶活力和果糖利用率影响因素的研究。结果表明,菌株B-1比较适合用于酿造葡萄酒,且β-葡萄糖苷酶主要存在于酿酒酵母细胞外;酿酒酵母的PFK及HK的活性与果糖利用率无相关关系。     

乙醇耐受性提高的酿酒酵母基因工程菌株的构建

将酿酒酵母转录激活因子Msn4基因置于组成型强启动子PGK下,构建重组整合表达质粒YPKRMsn4,r DNA介导整合到受体菌酵母工业菌株Y49的染色体中,筛选得到酿酒酵母菌YM-27。该菌过量表达酿酒酵母转录激活因子Msn4基因,乙醇耐受性有较大提高。构建的酿酒酵母工程菌运用在木薯乙醇工业生产中,可克服浓醪发酵中后期酵母菌受高浓度乙醇抑制而发酵活力不足的问题,可应用于乙醇浓醪发酵,为进一步构建具有高潜能的优良菌株奠定基础。     

盐酸戊乙奎醚片多次给药人体耐受性试验

目的: 评价健康人体对多次给药盐酸戊乙奎醚片的安全性和耐受性。方法: 16名健康受试者经筛选进入临床试验,参与为期 7 d 的连续给药耐受性试验。根据单次给药耐受性试验结果确定第一组多次给药剂量 0.6 mg•次^-1•d^-1,第二组给药剂量0.8 mg•次^-1•d^-1。观察用药前后受试者临床症状、生命体征,血常规、尿常规、血生化等实验室检查指标变化,并监测心电图,观察和记录不良事件。结果: 全部16例受试者均按方案完成试验。部分受试者给药后脉搏和心率出现低于正常范围的情况（P＜0.05）。其他生命体征、实验室检查未见有临床意义的改变。两个剂量组全部受试者均有口干、视近物模糊、瞳孔扩大等不良事件,均为本药已知的不良事件且严重程度均为轻度。心电图监测发现有窦性心动过缓和窦性心律不齐的情况,1例受试者部分时间点心电图显示Ⅰ度房室传导阻滞。无严重不良事件发生。结论: 盐酸戊乙奎醚片连续7次给药最大耐受剂量为0.8 mg,II、III期临床试验给药剂量还应结合药代动力学试验结果及临床用药经验确定。     

乙醇脱氢酶过表达对醋酸菌发酵产酸影响研究

目的:通过构建乙醇脱氢酶过表达基因工程菌株提高醋酸菌醋酸发酵产率。方法:PCR扩增沪酿1.01 Acetobacter pasteurianus CICC20001的乙醇脱氢酶亚基I(Alcohol dehydrogenase I,adh A)和乙醇脱氢酶亚基II(Cytochrome c subunit,adh B)基因,将其依次连接到质粒pBBR1MCS-4中,构建重组质粒pBBR-adh A-adh B,并将该重组质粒导入沪酿1.01,成功获得过表达乙醇脱氢酶的基因工程菌,并对基因工程菌与原始菌的微观形态以及发酵特性进行对比分析。结果:乙醇脱氢酶过表达基因工程菌的醋酸发酵产率和酒精耐受性都有所提高。结论:乙醇脱氢酶的过表达不仅提高了醋酸菌的产酸率,其酒精耐受性也有显著提高。     

侧孢短芽孢杆菌S62-9的生物学特性研究

以实验室选育的一株侧孢短芽孢杆菌Brevibacillus laterosporus S62-9为对象,体外研究其耐热性、耐酸性、耐胆盐性、黏附性以及药敏性等生物学特性。结果表明,B.laterosporus S62-9耐热性较好,85℃水浴5 min,存活率达86.20%;人工胃液中作用4 h,p H 2.0下的存活率最低,为85.70%,p H 3.0和p H 4.0下的存活率均高于95.00%;人工肠液中作用4 h,胆盐浓度为0.1%、0.2%和0.3%时的存活率分别为93.30%,91.70%和88.30%;对模拟胃肠道消化过程的耐受性高,p H 2.0胃液处理2 h后又经0.3%胆盐处理3 h,存活率达96.00%;营养体状态的B.laterosporus S62-9对Caco-2细胞体外的粘附率为20.70 CFU/cells,黏附能力高于对照组枯草芽孢杆菌K1;对养殖中常用的10种抗生素均未产生耐药性,是安全菌株。B.laterosporus S62-9优良的体外益生菌特性符合微生态制剂菌株的选育标准和要求,为其微生态制剂的开发与应用奠定了理论基础。