食品外肽酶的研究进展

外肽酶包括氨肽酶和羧肽酶两大类。当外肽酶催化多肽水解时,产物苦味减轻,同时生成的游离氨基酸和小肽类物质能够形成食品良好风味,或作为风味前体物质。外肽酶能够在食品后熟阶段起作用,如水果成熟、种子萌发和肉类陈化,也能够在食品加工处理过程中起作用,如干燥、热处理和发酵,从而决定终产品品质的优劣。外肽酶在食品中的重要应用主要体现在能够水解疏水性苦味肽,并去除苦味。本文较为系统地综述近年来外肽酶及其在食品中的研究现状,主要包括外肽酶的分类、结构、反应特性,以及在食品加工过程中对蛋白质水解产物的最终产品良好风味的贡献机制。     

通过改造底物结合区氨基酸疏水性提高氨肽酶热稳定性

通过提高枯草芽孢杆菌来源的氨肽酶底物结合区域氨基酸的疏水性,提高氨肽酶YwaD的热稳定性。基于氨肽酶底物结合区域氨基酸特性分析,选定亲水性氨基酸残基N385为目标,通过定点突变使其突变为疏水氨基酸残基L385,获得突变体N385L。结果表明,与野生型ywaD相比,突变体N385L酶热稳定性明显提高,在80℃放置30 min,野生型YwaD完全失活,而突变体N385L仍保留20%的酶活力。另外,突变型N385L对底物氨基酰基-硝基苯胺的亲和力提高了47.4%,催化效率提高了28.5%。该研究有利于提高氨基肽酶工业应用前景。     

褶牡蛎氨肽酶B的分离纯化和性质研究

氨肽酶是一类能特异水解蛋白质N端氨基酸残基的外切酶,在食品行业有着广阔的应用前景。以褶牡蛎(Alectryonella plicatula)为原料,通过硫酸铵盐析,DEAE-sepharose,phenyl-sepharose及羟基磷灰石柱层析,分离纯化得到了一种高效水解碱性氨基酸的氨肽酶,其活性能被氨肽酶特异性抑制剂bestatin有效抑制。双向电泳结果显示该酶的分子质量约为100 ku,pI约为5.8。通过肽质量指纹图谱对其进行鉴定得到12个肽段,共含138个氨基酸残基,这些氨基酸序列与太平洋牡蛎中嘌呤霉素敏感性氨肽酶一致,表明纯化的酶为氨肽酶B。褶牡蛎氨肽酶B的二级结构以无规卷曲与反向平行为主,其中无规卷曲占42.6%,反向平行占32.0%。动力学研究获得其K_m和k_(cat)值分别为1.5μmol/L和117.5 s~(-1),k_(cat)/K_m为78.3 L/(μmol·s)~(-1)。在35℃,pH值7.0的条件下,该酶具有最大催化活性,能高效水解氨肽酶底物Lys-MCA和Arg-MCA,释放出游离态的Lys和Arg,推测与牡蛎呈味相关。     

米曲霉产氨肽酶发酵条件优化

该文对1株产氨肽酶的米曲霉产酶条件进行单因子优化。确定产酶培养基和培养条件为:2%黄豆粉、0.3%K2HPO4,0.2%油酸,初始pH 5.0。在30℃,200 r/min下液体培养48 h后胞外酶活达497.13 U/mL,较优化前提高了3倍以上。该米曲霉营养要求简单,氨肽酶产量高,发酵周期短,非常适于生产研究。     

氨肽酶底物L-丙氨酰-7-氨基-4-甲基香豆素的合成研究

本文以间氨基苯酚为起始原料,首先用氯甲酸甲酯对氨基进行保护,然后与乙酰乙酸乙酯在浓硫酸催化下闭环,最后在氢氧化钾溶液中脱去氨基保护基得到7-氨基-4-甲基香豆素。N-叔丁氧羰基丙氨酸与7-氨基-4-甲基香豆素缩合后脱去丙氨酸上的叔丁氧羰基得到目标产物L-丙氨酰-7-氨基-4-甲基香豆素。该合成路线操作安全、后处理简单、产率高,具有很高的实用价值。     

(2S,3R)-2-羟基-3-氨基-4-苯基丁酸的合成方法进展

(2S,3R)-2羟基-3-氨基-4-苯基丁酸（AHPBA）是制备Bestatin、Phebestin和Probestin等氨肽酶N(Aminopeptide N)抑制剂的关键中间体。本文从氨基酸法（D-苯丙氨酸、L-天门冬氨酸、苹果酸二酯）、有机金属催化法（双功能铝配合物）、酶催化法（脂肪酶和全细胞酶）以及其它方法对此中间体的合成方法及路线进行综述和分析。经比较,有机催化法、酶法以及苯乙酮法因其具有经济有利、条件温和或路线简单特点,具有潜在的工业化应用前景。同时,未来人们对AHPBA的合成开发将集中在对已有工艺路线的改进与优化。     

氨肽酶的特性及在虾风味调料制备中的应用研究

单因素试验及水解工艺条件优化试验结果表明，在虾风味调料制备中，最适的复合酶是氨肽酶＋碱性蛋白酶．最佳工艺条件是：初始pH8．0，水解过程中不控制pH，水解温度50℃，碱性蛋白酶1％＋氨肽酶1％，水解5h，氨基氮含量达1．3852。     

碳源对Bacillus cereus CZ氨肽酶产量及糖代谢酶活性的影响

本文对Bacillus cereus CZ生产亮氨酸氨肽酶(LAP)进行了研究。结果表明,L-阿拉伯糖最利于LAP生产,D-半乳糖和乳糖也有较好效果,葡萄糖、麦芽糖、蔗糖或碳酸氢钠则强烈抑制LAP产生。L-阿拉伯糖和单糖混合、乳糖或半乳糖与葡萄糖混合均大大降低LAP产量。乳糖、葡萄糖有利于细胞生长。2%的乳糖、半乳糖或阿拉伯糖作为碳源,发酵48 h时LAP产量并没有达到最高。对于三种糖代谢酶,β-半乳糖苷酶受乳糖强烈诱导,D-半乳糖则强烈抑制该酶的活性,半乳糖激酶受D-半乳糖强烈诱导。L-阿拉伯糖异构酶受L-阿拉伯糖强烈诱导。当L-阿拉伯糖和半乳糖的浓度为4%时,LAP产量达到最高。胞外半乳糖激酶随D-半乳糖增加而降低,而胞内正好相反。L-阿拉伯糖异构酶活性随L-阿拉伯糖浓度增加而增加。当L-阿拉伯糖为4%时,LAP产量在发酵56 h达到最高,但在半乳糖为4%时,LAP产量随时间延长而增加。     

亮氨酸氨肽酶LapA在无孢黑曲霉中的重组表达优化及酶学性质

针对目前国产食品级亮氨酸氨肽酶的工业生产产量不高的现状,将米曲霉、黑曲霉和酱油曲霉的5 个亮氨酸氨肽酶基因（lapA、lap1O、lap2、lap1S、lap1N）在低蛋白背景的无孢黑曲霉HL-1中进行重组表达,通过信号肽替换对其编码区进行改造,利用杂合启动子PnaII及营养缺陷标记pyrG构建表达载体,并基于规律间隔成簇短回文重复序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR）/Cas9工具设计亮氨酸氨肽酶的基因组定点整合策略,获得高活力的亮氨酸氨肽酶表达菌株,重组菌株LapA-C的亮氨酸氨肽酶活力达到11 701.2 U/mL,比未利用CRISPR工具的LapA-T重组表达菌株的酶活力（2 476.0 U/mL）提高了约3.7 倍。此外,通过融合6×His标签实现了重组亮氨酸氨肽酶LapA的纯化,并对其进行了酶学性质研究：蛋白质大小约为35.0 kDa,重组亮氨酸氨肽酶LapA最适pH值为8.5,最适温度为65 ℃。综上所述,本研究基于CRISPR策略成功实现了亮氨酸氨肽酶在黑曲霉中的高效重组表达。     

重组枯草芽孢杆菌高产氨肽酶策略与提取工艺优化

研究不同的产酶促进剂(渗透压调节剂、表面活性剂、有机酸盐)对重组枯草芽孢杆菌产氨肽酶的影响,并对氨肽酶的提取工艺进行优化。获得产酶促进剂优化组合为:氯化钾0.1 mol/L、吐温802.4μL/m L、L-谷氨酸钠0.6%、酒石酸钾0.7%;优化培养条件为:装液量60 m L/250 m L、初始p H 7.5、接种体积分数5%、转速220 r/min、培养时间36 h。在上述优化条件下,该重组菌株产氨肽酶酶活达232.5 U/m L,是优化前的3.32倍。该重组氨肽酶发酵液经低速离心、双水相萃取、超滤浓缩提取后,回收率达67.23%,纯化倍数为8.29。