家蚕化学诱变剂及诱导突变体的筛选

在家蚕Bombyx mori基因组计划完成之后,其功能基因组研究成为该领域的最重要课题。突变体是功能基因组学研究的重要材料,因此,通过人为诱导获取大量的突变系统是及其重要的手段。本研究用化学诱变剂ENU、MNU、DES、5-BU、EMS诱导处理家蚕标准品种C108,筛选获得了非滞育红卵,长圆筒茧、小茧、丝胶茧及绵茧突变体,致死突变体及无鳞毛蛾翅突变体。结果还表明： MNU、DES诱变家蚕的突变效率高,注射翅原基比腹部更方便且效果好,化学诱导雄体比雌体的效果好; 在时期上,注射蛹和蛾都有诱导效果。上述突变体大多为致死性突变,推测其可能与致死性基因突变有关。同时,本研究为应用TILLING技术鉴定家蚕更多目的基因突变体提供了有效的材料。     

家蚕茧质性状的性别效应预测

研究采用混合线性模型,对家蚕全茧量、茧层量、茧层率和蛹体重等性状的性别效应进行理论估算：全茧量、茧层量、茧层率和蛹体重等4性状的性别随机效应的方差的概率和性别随机效应的预测值概率都达到极显著水平,证明全茧量、茧层量、茧层率和蛹体重等四性状的性别效应极显著,这完全符合实际情况。全茧量、茧层量、茧层率和蛹体重等4性状的性别效应预测值雌（雄）分别为0.248g（-0.247g）、2.423cg(-2.394)cg、-1.976%(1.992%)和0.224g(-0.223g)。性别效应调整后各性状均呈单峰正态分布,符合QTL分析对数量性状连续正态分布的要求。     

家蚕AFLP连锁框架图谱的构建

利用改进的AFLP分子标记方法,对家蚕Bombyx mori回交一代BC1群体进行连锁图谱的构建。经17组AFLP引物的选择性扩增,共得到430个多态位点,卡方检验后有253个为有效位点。利用Mapmaker/Exp (Version 3.0b)软件作连锁分析,其中163个标记分属28个连锁群,连锁群标记数变化范围是2～28个,平均每个连锁群标记数为5.8个,该图覆盖的基因组长度为2.998.9cM(图距单位),连锁群长度变化范围为4.5～652.8 cM,连锁群的平均长度为107.1 cM,平均图距为4.5～36.7 cM。     

家蚕母性基因的表达序列标签分析

为了研究家蚕Bombyx mori卵中储存的母性遗传信息,以未受精的肾脏型和正常型蚕卵为材料构建了cDNA文库,并对其随机测序,共获得391条表达序列标签(EST)序列,经拼接后得到374条非重复序列。生物信息学分析发现,172个非重复序列与国际数据库GenBank和silkbase中的已知基因具有较高的相似性。除3个已知母性基因外,其余主要与DNA复制、能量代谢、信号转导、转录、蛋白质结构以及胚胎发育中个体形成等相关。该结果可为进一步研究家蚕胚胎早期发育的调控提供基础数据。     

利用SADF法进行家蚕基因组DNA多态性分析

从家蚕品种C108和大造后部丝腺提取的基因组DNA,用PstⅠ酶解后与自己设计的人工接头相连,并用与人工接头序列相匹配的选择性引物进行选择性PCR扩增(selective amplification).扩增产物经琼脂糖电泳检测显示,用SADF法在两品种中能检测到稳定的DNA多态性片段.     

应用频数分布面积法定位家蚕QTL

利用生态型差异较大的两个家蚕品种７８２和ｏｄ１００作正反杂交,得到Ｆ１。让Ｆ１雄蚕与叠双隐性标记的ｏｄ１００回 到回交子代。     

含有母性影响遗传基因的连锁定位系的构建

母性影响遗传基因由于其杂交后代的表型受母本基因型的影响, 而不能直接反映当代个体的基因型, 这给连锁定位测交亲本(三隐性或双隐性系统)的培育带来困难, 从而影响这类基因的定位研究。设计了一套杂交培育方案, 其核心是使母性影响遗传基因先纯合, 再使非母性影响遗传基因纯合。采用所设计的方案, 成功培育了家蚕第13连锁群的赤蚁(ch)、无鳞毛翅(nlw, 新突变)和褐色卵t (b-t, 母性影响遗传)的三隐性系统, 并培育了第19连锁群的狭胸(nb)和第二肾形卵(ki-2, 母性影响遗传, 待定位突变基因)的双隐性系统。     

家蚕保存系统红色卵的遗传分析

用遗传背景清楚的家蚕Bombyx mori红卵（re）、白卵(w-2、pe)、第4褐卵（b-4）的标志基因系统和正常型黑卵系统与我国家蚕基因库保存的20个红色卵系统杂交,进行顺反测验,分析了它们的卵色支配基因及遗传规律。结果发现：①在03-310系统中存在家蚕卵色新突变pink egg,与红卵re 等位,基因符号为re^p,表型特征为：卵淡红色,成虫蛾眼也为淡红色;②6个系统为红卵（re）的纯合系统,还有５个系统除具有re／re基因型外,还具有支配白色卵或浅红色或橙红色卵的突变基因;③２个系统为第4褐卵（b4）的纯合系统; ④6个系统的红褐色卵为母性影响遗传;⑤发现家蚕卵色基因b-4和r-e的互补关系,b-4/b-4 re/re基因型表现为新的卵色——橙黄色。     

家蚕卵黄原蛋白及其受体基因

家蚕小卵突变体 (Smalleggmutant ,sm) ,其卵体积仅及正常卵的 2 / 3,不能受精而致死。因其卵母细胞不能正常吸收卵黄原蛋白 (Vg) ,人们认为其原因可能是卵黄原蛋白受体基因 (VgR)突变所致。本研究首先通过克隆筛选和基因组序列分析 ,获得了 2 5 6 4bp含有 ployA的家蚕卵黄原蛋白受体基因 (BmVgR)片段。将该基因片段的预测蛋白与其它物种的VgR/YPR和低密度脂蛋白受体 (LDLR)家族比较 ,发现该基因具有LDLR家族的基本结构特征。其次 ,经RT PCR检测 ,结果表明BmVgR在sm的不同时期的卵母细胞中都能正常转录。最后 ,分别对sm不同发育时期的体液和卵的总蛋白进行SDS PAGE分析 ,发现该突变体的卵母细胞不能正常摄取体液蛋白 (包括Vg)。综合分析 ,sm不能正常摄取Vg ,可能并不是VgR的功能异常导致 ,而是与滤泡细胞异常有关