对大黑鳃金龟甲幼虫高效的苏云金芽胞杆菌筛选及cry基因鉴定

为获得对大黑鳃金龟甲幼虫具有较高杀虫活性的菌株,利用拌土法测定了本实验室分离的500株苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)对大黑鳃金龟甲的杀虫活性,建立Bt菌株比较鉴别技术来进行多样性分析,并对菌株的晶体形态及幼虫感染Bt后的中肠组织切片进行观察。结果显示,从500株Bt菌株中筛选到42株对大黑鳃金龟甲幼虫具有不同程度活性的菌株,分属于14个菌株类型;其中有10株校正死亡率大于60%,261-1菌株杀虫活性最高,7 d校正死亡率达100%。从14个菌株类型中各选取1个代表菌株进行基因鉴定,仅P65-1、1126-1、FCD114和78-2菌株分别含有cry8Ma、cry8Ca、cry8Ab、cry8Ga、cry8Ea共5个cry8类新基因,其它10个菌株均不含cry3、cry8、cry18、cry23、cry37、cry43等对鞘翅目害虫有效的杀虫基因。14个菌株中,78-3、127-2和1198-1菌株能产生双锥体型晶体,261-1、FCD114、P65-1、FTL84、78-2和1126-1菌株能产生球形晶体。幼虫感染261-1、1198-1、FCD114、1126-1、QDL40-2菌株后,中肠组织发生明显的病理变化:2 d时肠壁细胞明显出现空洞化,排列疏松,4 d时受到严重破坏并脱离底膜。表明筛选到的Bt菌株具有防治大黑鳃金龟甲幼虫的潜力。     

对暗黑鳃金龟成虫具有杀虫活性的Bt蛋白筛选

暗黑鳃金龟Holotrichia parallela是一种重要的农业害虫,其成虫和幼虫均能对多种作物造成严重危害。为筛选对暗黑鳃金龟成虫具有毒杀活性的Bt蛋白,本研究首先对暗黑鳃金龟成虫的生活习性进行观察,用浸泡蛋白的榆树叶饲喂成虫,建立了Bt蛋白对暗黑鳃金龟成虫的生物学活性测定方法;制备了6种Bt Cry8类杀虫晶体全长蛋白和胰蛋白酶消化蛋白,对暗黑鳃金龟成虫进行了杀虫活性测定。初筛结果发现Cry8Ga1原毒素和消化蛋白均对暗黑鳃金龟成虫具有较高毒杀活性,其在浓度1.0 mg/mL时对暗黑鳃金龟成虫的7 d校正死亡率分别为100%和55%。为更进一步确定Cry8Ga1蛋白的杀虫活性,进行了致死中浓度测定,7 d生测结果显示,Cry8Ga1原毒素的LC₅₀为0.387 mg/mL （95%置信区间为0.108~0.746 mg/mL）,Cry8Ga1蛋白经胰蛋白酶消化后的LC₅₀为0.702 mg/mL （95%置信区间为0.150~2.664 mg/mL）。取食Cry8Ga1原毒素蛋白及其消化蛋白后的暗黑鳃金龟成虫中肠细胞产生显著的病理学变化。本研究筛选到对暗黑鳃金龟成虫有毒杀作用的Bt蛋白,研究结果将为金龟子的生物防治开辟新的途径。     

对蛴螬有活性的苏云金芽胞杆菌菌株的筛选与基因鉴定

为了寻找对地下害虫蛴螬有杀虫活性的基因资源,以实验室分离的500株苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)菌株为材料,通过杀虫活性测定筛选到43株对蛴螬有活性的菌株,其中菌株C9对3种供试昆虫均有活性.光学及扫描电镜检测发现这些菌株均释放球形晶体.SDS-PAGE分析显示这些菌株均表达约130kD的蛋白.采用3种方法分析43株菌株的杀虫晶体蛋白基因类型,结果显示:其中21株只含cry8Ca;13株同时含cry8Ca和cry8Ea基因;QC4等8株菌株只能用引物HRM8F/HRM8R获得高度保守区域约110bp的扩增产物,说明这些基因的5'端序列与已知基因差异较大.测序结果经BLAST分析显示,产物序列同cry8基因的相似性均在98%以上,但其全长基因类型还需要其它方法确定.菌株QCM的PCR-RFLF图谱不同于已发现的cry8基因,推测其中含有新基因.     

提升Bt和球孢白僵菌防治蛴螬效果的颗粒载体

为提升微生物杀虫剂对地下害虫蛴螬的防治效果,本研究研制了一种颗粒载体。首先,选择了生产企业常用的单螺杆膨化机作为生产设备,进一步通过颗粒大小、结构稳定性、生产过程等关键因素比较,确定了颗粒载体的物料配方（玉米粉、花生粕、膨润土比例为1：3：2,加水量20%）。进一步研究结果显示,Bt、球孢白僵菌等对蛴螬有效的杀虫微生物能够在颗粒载体上增殖生长。此外,本研究还发现对暗黑鳃金龟有效的Bt185与球孢白僵菌间无拮抗;暗黑鳃金龟幼虫的生物活性测定结果表明,颗粒载体与Bt185或球孢白僵菌结合后的校正死亡率为使用Bt185或球孢白僵菌单一粉剂的2倍,并且颗粒载体与这两种菌株协同使用的校正死亡率达77.55%,显著提升了Bt和球孢白僵菌单一粉剂对蛴螬的杀虫效果。上述研究结果为研制新型高效蛴螬生物杀虫剂提供了新思路,对突破目前蛴螬生物防治的瓶颈具有重要意义。     

白僵菌在暗黑鳃金龟防治中的应用

暗黑鳃金龟是目前农业生产上为害较重的地下害虫之一,而化学防治极易对环境和农作物造成污染,并对天敌昆虫产生伤害。生物防治以其无毒、无害、无污染、不易产生抗药性和高效等优点,在植物病虫害防治中越来越受到人们的重视。白僵菌是害虫生物防治中最重要的虫生真菌。分析了白僵菌的致病机制及影响因素,致力培养对暗黑鳃金龟专一性和致病性较强的白僵菌种,以期为暗黑鳃金龟的生物防治提供切实可行的方法。     

食物对暗黑鳃金龟卵巢发育和生殖力的影响

通过对取食不同寄主植物的暗黑鳃金龟生殖力和卵巢发育的观察发现,食物对暗黑鳃金龟产卵量影响显著,取食榆树叶的暗黑鳃金龟产卵量最高,平均单雌产卵量为39.30粒;取食桃树叶的暗黑鳃金龟产卵量最低,平均单雌为4.72粒;两者相差8倍。食物对暗黑鳃金龟的卵巢发育也存在明显影响,取食榆树叶的暗黑鳃金龟卵巢最长,平均为9.34mm;取食桃树叶的暗黑鳃金龟卵巢最短,平均为6.12mm,与取食榆树叶的卵巢长度差异显著。产卵量(Y)与其产卵前期(X1)和卵巢长度(X2)存在极显著的线性相关,并通过回归分析建立了群体产卵量的计算公式:Y=-713.82-9.23 X1+160.53 X2(P0.01)(R2=0.79)。     

嗜菌异小杆线虫沧州品系对暗黑鳃金龟幼虫的致病力

室内测定了嗜菌异小杆线虫沧州品系在不同侵染剂量、不同环境温度及不同土壤湿度条件下对暗黑鳃金龟幼虫的致病力。结果表明,幼虫的死亡率随线虫施用剂量和处理时间的增长而升高,其中侵染期线虫剂量为400、250、200条/mL时,幼虫死亡率分别在处理后72、96 h和120 h达到100%;30℃和25℃是该线虫侵染的最佳温度,幼虫死亡率分别在处理后48 h和96 h达到100%;土壤湿度为14%和17%时,幼虫死亡率分别在96 h和120 h达到100%。     

金丝小枣浆烂果病发病因素研究

金丝小枣浆烂果病病原菌为囊孢壳菌(Physalospora obtuse),无性世代为梭壳孢菌(Fusicoccum sp.)[1].对影响金丝小枣浆烂果病发病的因素,苏安仁、闫振华也曾做过观察,指出金丝小枣浆烂果病发病程度在品系间差异较大,偏施氮肥可诱导发病[2,3].但目前有关金丝小枣对浆烂果病的抗病因素的详细资料未见报道.笔者于1998～2000年连续3年对金丝小枣浆烂果病的抗病因素进行了研究.     

金丝小枣浆烂果病症状、危害及病原菌鉴定

金丝小枣浆烂果病严重危害我国北方枣树，并且逐年加重。本研究通过室内分离培养与田间调查，经多年多地试验，查明此病的症状、危害及病原菌。结果显示：金丝小枣浆烂果病在河北、山东、天津的产区普遍发生，以河北泊头市发病最重。该病在枣果进入白熟期(8月20日左右)开始发病，形成侵染点明显的红色近圆形软腐病斑。1998—2000年3年平均发病率和病情指数分别为36．7％和26．9。依据柯赫氏法则对金丝小枣浆烂果病病原菌进行了研究，根据病原菌形态特征，病原菌有性阶段鉴定为囊孢壳菌(Physalospora obtuse，(Schw．))，无性世代鉴定为梭壳孢菌(Fusicoccum sp．)。经黑光灯诱导后，囊孢壳菌在室内PDA培养基上可形成子座与分生孢子器。有性世代的子囊壳与子囊孢子只发现于越冬后的病枣果中。