HSP70-TKD诱导的NK细胞杀伤肝癌细胞的实验研究

目的:探讨从人外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)中获得足够数量和高细胞毒活性的CD3-CD56 NK细胞的方法,并观察其对肝癌细胞HepG2杀伤效应.方法:以干细胞培养基(SCGM)为基础培养基,在不同浓度的抗CD3单抗、IL-2和PHA的培养条件下,从健康人PBMC中高效扩增获得CD3-CD56 NK细胞;以不同剂量的HSP70-TKD诱导NK细胞的活性,MTT法测定HSP70-TKD诱导的NK细胞对HepG2和榄香烯处理的HepGZ细胞的杀伤活性.结果:建立了从人PBMC体外扩增CD3-CD56 NK细胞体系:以SCGM为基础培养基,在600 U/mL IL-2、500 μg/L抗CD3单抗和50 mg/L PHA联合作用下,培养14 d细胞扩增了116倍,舍有(66.97±8.76)?3-CD56 NK细胞;HSP70-TKD诱导的NK细胞对HepG2杀伤活性低.与未经TKD诱导的NK细胞之间差异无统计学意义,P=0.298;而对税香烯处理过的HepG2杀伤活性高,诱导组与未诱导组之间差异有统计学意义,P=0.008;当TKD浓度为2.0 mg/L时,杀伤活性最高为(58.8±3.4)%.结论:以干细胞生长培养基为基础培养基,在抗CD3单抗和IL-2协同刺激下体外大量扩增NK细胞,HSP70-TKD诱导的NK细胞对细胞膜HSP70阳性的肿瘤细胞杀伤活性高,而对于细胞膜HSP70低表达的肿瘤细胞杀伤活性低.     

HSP70-TKD诱导NK细胞对胰腺癌细胞杀伤作用及其机制的探讨

目的:探讨从人外周血单核细胞(PBMC)由干细胞培养基扩增得到的NK细胞,在热休克蛋白70短肽(HSP70-TKD)刺激下杀伤细胞膜HSP70表达阳性胰腺癌细胞的机制。方法:用干细胞培养基从健康人PBMC中高效扩增得到CD3-CD56+NK细胞,ELISA方法测定HSP70-TKD诱导的NK细胞分泌IFN-γ的水平;ELISPOT方法分析其颗粒酶-B的表达情况;用MTT法测定HSP70-TKD诱导的NK细胞,对细胞膜HSP70表达阳性的胰腺癌细胞Colo+和表达阴性的胰腺癌细胞Colo-杀伤活性;从而分析其杀伤活性与IFN-γ分泌和颗粒酶-B表达的相关性。结果:由外周血扩增NK细胞在2.0μg/mL的HSP70-TKD刺激下,其IFN-γ分泌从刺激前的(8.9±0.7)ng/mL增加到(30.2±1.3)ng/mL,差异有统计意义,P<0.05;而颗粒酶-B的表达从(3.2±0.3)%增加到(21.2±0.6)%,差异有统计意义,P<0.05。HSP70-TKD诱导的NK细胞对Colo-杀伤活性低,与未经诱导的NK细胞比较差异无统计学意义;而对Colo+杀伤活性高,诱导组与未诱导组之间差异有统计学意义;当TKD浓度为2.0μg/mL时,杀伤活性最高为(60.1±2.8)%,而未诱导的NK细胞杀伤活性为(27.8±2.6)%。结论:NK细胞在2.0μg/mL的HSP70-TKD诱导下,其IFN-γ分泌、颗粒酶-B的表达和对Colo+杀伤活性达到最高,推断HSP70-TKD诱导NK对细胞膜HSP70表达阳性细胞的杀伤可能与其IFN-γ分泌和颗粒酶-B的表达有关。     

EphB4及其配体EphrinB2在食管鳞癌中表达及其与血管生成的关系

  目的  探讨EphB4受体及其配体EphrinB2在食管鳞癌组织中的表达及其与血管生成的关系。  方法  应用免疫组织化学Envision plus法检测60例食管鳞癌和10例癌旁组织中EphB4受体及其配体EphrinB2的表达和VEGF的表达, 采用逆转录多聚酶链反应（RT-PCR）法检测60例食管鳞癌和10例癌旁食管组织中EphB4、EphrinB2和VEGF mRNA的相对含量, 并分析EphB4、EphrinB2和VEGF的表达的相关性。  结果  食管鳞癌组织中EphB4、EphrinB2、VEGF mRNA和蛋白的表达均高于癌旁正常食管黏膜, 差异有统计学意义（P < 0.05）。EphB4 mRNA和EphrinB2 mRNA表达正相关（r=0.541, P < 0.05）, EphB4 mRNA、EphrinB2 mRNA均和VEGF mRNA表达正相关（r=0.642, r=0.582;P均 < 0.05）。  结论  EphB4和EphrinB2在食管鳞癌中高表达, 与血管生成密切相关。      

巢式RT-PCR对肺癌外周血中微转移灶的检测和半定量测定

目的对肺癌外周血中微转移灶的检测和半定量测定。方法以CK-19为标记,采用巢式RT-PCR和半定量方法对肺癌患者外周血中微转移灶的检测,比较治疗前后外周血中癌细胞数的相对变化。结果60例肺癌中有29例CK-19阳性,18例健康人中,仅1例检测出CK-19阳性,7例肺良性疾病患者有2例为CK-19阳性。实验组CK-19阳性率48%(29/60)与对照组12%(3/25)相比有极显著差异(P<0.01)。2例肺癌患者化疗前相对癌细胞数分别为25和16个,经1周期化疗后,相对癌细胞数分别为5和1个。结论以CK-19为标记,采用巢式RT-PCR方法检测肺癌患者外周血中的癌细胞有较高敏感性和特异性,半定量RT-PCR法,能早期反映外周血中癌细胞数的相对变化情况,有助于对临床疗效及早做出评价。     

Expression of RHGM-CSF gene in eukaryocyte by lipofection

Recombinant human GM-CSF has been widely used in clinic since it was cloned in 1985.[1] It is not only an effective hematopoiesis factor, but also a cytokines that can stimulate the efficient and persistent antitumor activity in the whole body.[2] At present, recombinant hGM-CSF gene has been expressed successfully in E. coil and used in clinic. Because of the product's purification and lack of sugar chain, it is more significant to produce nearly natural hGM-CSF with sugar chain conside…     

GM-CSF基因重组腺病毒载体的构建及鉴定

目的:构建人粒细胞 巨噬细胞集落刺 激因子(GM CSF)基因的重组腺病毒载体,为进 一步研究GM CSF基因在肿瘤基因治疗中的应 用提供实验基础。方法:采用PCR方法,从重 组质粒pcDNA3.1 GM CSF扩增出GM CSF 基因片段,通过穿梭质粒pShuttle,将带有CMV 启动子的目的片段克隆入Adeno X腺病毒 DNA中,获得重组腺病毒DNA,通过脂质体转 染HEK293细胞,经包装扩增后,获得重组腺 病毒Adeno X GM CSF,PCR鉴定,ELISA法 检测表达产物。结果:含GM CSF基因的重组 腺病毒Adeno X GM CSF构建成功,经PCR鉴 定和DNA测序等证实了其正确性,重组腺病毒 上清液中GM CSF表达量达26ng/mL。结论: 含GM CSF基因的重组腺病毒构建成功。     

长期传代人脐带间充质干细胞的特性及功能

目的：探讨传至10 代（P10）的人脐带来源间充质干细胞（P10-hUC-MSC）的生物学特性及功能。方法：人脐带来源于厦门弘爱医院（伦理批号：HAXM-MEC-20201012-037-01），分离、收集、培养hUC-MSC 并传代培养，收集P1-、P10-hUC-MSC， FCM检测hUC-MSC 表型，细胞衰老β-半乳糖苷酶染色法及FCM法检测终末期细胞衰老与凋亡情况，秋水仙碱处理检测细胞染色体稳定性，体外成脂、成骨诱导实验检测其多向分化能力，以不同比例与外周血单个核细胞（PBMC）混合培养后FCM检测T细胞亚群及表型变化。结果：成功分离和培养的P10-hUC-MSC与P1-hUC-MSC 的表型相似，表现为CD45、CD34、HLA-DR表达阴性而CD105、CD90 阳性率 95%。终末期的P1-hUC-MSC 和P10-hUC-MSC 均表现出β-半乳糖苷酶表达阳性和早期凋亡特征，细胞染色体核型一致且保持稳定，未发生转化现象。P1-、P10-hUC-MSC在体外都可被诱导分化成脂肪、成骨细胞。P10-hUC-MSC与PBMC 以1∶1 混合培养7 d 后，可显著上调CD4+/CD8+ T细胞比值、CD4+ Treg 细胞比例和PD-1表达（均P<0.01）。结论：长期传代的P10-hUC-MSC仍然保持其生物学特性和安全性，并具备多向分化能力及免疫调节能力，这为最大限度发挥hUC-MSC的临床放疗损伤修复与预防作用提供了前期实验依据和指导。