肝癌细胞线粒体蛋白的MALDI-TOF质谱鉴定方法研究

目的:探索胶上蛋白原位酶切、肽质量指纹图(PMF)分析以及数据库检索方法的优化条件,建立适合于亚细胞比较蛋白质组学研究的质谱鉴定策略.方法:从考马斯亮蓝染色的2-DE胶上取下牛血清白蛋白(BSA)标准蛋白进行胶内原位酶切,与基质(CHCA)混匀后进行MALDI-TOF MS分析;对来源于人肝细胞癌细胞株QGY-7703线粒体的差异表达的候选蛋白点L9,按照通过BSA标准蛋白优化的条件进行MALDI-TOF质谱鉴定;其肽质量指纹图(PMF)经MS-Fit检索.结果:经数据库检索,BSA的肽质量指纹图(PMF)匹配肽质量数为10/11,序列覆盖率为19%,说明实验条件完全可信.候选蛋白点L9的PMF数据经数据库检索后,排名前两位的蛋白均为OXCT(3-oxoacid CoA transferase 1 precursor),其匹配肽段为9/13,序列覆盖率为24%;且OXCT的理论分子量(56kda),理论等电点(7.1),与胶上L9蛋白的位置相符.故候选蛋白点L9确认为OXCT(3-oxoacid CoAtransferase1 precursor).结论:本文所确定的鉴定策略适用于线粒体比较蛋白质组学的研究.     

CCAAT增强子结合蛋白α在甾醇类新药NSC67657诱导HL60细胞向单核系分化中的作用

目的 探讨CCAAT增强子结合蛋白α(C/EBPα)在甾醇类新药NSC67657诱导HL60细胞向单核系分化中的作用.方法 采用NSC67657诱导HL60细胞分化,流式细胞仪检测细胞表面分化抗原CD14的表达.应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot方法连续检测C/EBPα基因和蛋白在细胞分化前后的表达情况.构建pDsRed-C/EBPα真核表达载体,基因测序后采用电转染技术,将真核表达载体转入HL60细胞中,并进行表达验证.采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法、瑞氏染色和流式细胞技术,观察转染细胞在NSC67657作用前后的增殖和分化情况.结果 10 μmol/L NSC67657可以诱导HL60细胞向单核系分化,连续诱导5 d后,有93.9%的细胞有CD14阳性表达.分化后的HL60细胞中,C/EBPα基因和蛋白表达均先升高后下降,分别在第2天和第3天达到峰值.真核表达载体构建成功,通过电转染和G418筛选,可获得90%以上阳性克隆.C/EBPα高表达可使HL60细胞增殖明显减缓,表面抗原CD11b的表达可达到(50.44±4.92)%.在NSC67657处理的重组质粒转染HL60细胞中,细胞单核系分化受到抑制,保留部分粒系分化.结论 NSC67657诱导HL60细胞向单核系分化不一定通过C/EBPα蛋白的协调作用,但C/EBPα蛋白高表达可以阻止NSC67657诱导HL60细胞向单核系分化的进程.     

重组人睫状神经因子聚乙二醇化条件的优化

目的 对单甲氧慕聚乙二醇丁醛(mPEG-ButyrALD,相对分子质量20×103)修饰重组人睫状神经因子(rh-CNTF)的条件进行优化.方法 优化了pH值、温度、时间、rh-CNTF与PEG的修饰比例、rh-CNTF浓度等修饰条件,并对修饰产物行分离纯化.鸡胚背根节培养法检测和比较rh-CNTF和PEG-rhCNTF的体外生物学活性.结果 rh-CNTF与PEG的修饰比例、rh-CNTF的浓度和pH值是主要影响因素,最佳pH为6.5,最佳rh-CNTF浓度为1～2 mg/ml,rh-CNTF与PEG的最佳质量比为1:1,时间和温度影响甚微.rh-CNTF的体外神经营养活性约为PEG-rhCNTF的2倍.结论 本法优化了修饰重组人睫状神经因子的条件.     

重庆垫江牡丹皮HPLC指纹图谱研究(Ⅰ)——不同因素的影响及牡丹皮最适宜种植条件选择

目的:比较不同因素对重庆垫江牡丹皮的高效液相色谱指纹图谱的影响,探索垫江牡丹皮最适宜种植条件。方法:采集不同条件下种植的重庆垫江牡丹皮样品,高效液相色谱法绘制指纹图谱,对不同栽培品种、种植土壤、海拔高度、生长年限、采收月份进行相似度计算和色谱数据分析。结果:不同栽培品种、种植土壤、海拔高度、生长年限、采收月份等因素对重庆垫江牡丹皮质量均具有明显的影响;红花牡丹(太平红)和白花牡丹(凤丹白)2个栽培品种均适宜垫江县种植,但红花牡丹皮更具优势;垫江牡丹皮的最适宜种植土壤为矿子黄泥,最佳海拔为500~700m,最佳生长年限为5a,最佳采收季节为10~11月份。结论:所得数据可为垫江牡丹皮实施GAP提供科学依据。     

重庆垫江牡丹皮HPLC指纹图谱研究(Ⅲ)——刮丹皮指纹图谱

目的:建立重庆垫江药用牡丹刮丹皮的标准高效液相色谱(HPLC)指纹图谱,为科学评价与有效控制牡丹皮的质量提供新的依据和技术手段。方法:利用HPLC法测定重庆垫江产刮丹皮样品10批;采用国家药典委员会制定的《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》(2004A版)专用软件进行自动匹配、相似度计算和色谱数据分析。结果:10批刮丹皮样品共有峰12个,共有峰面积占总峰面积的90.61%;各样品与自动生成对照图谱的相似度达0.9以上,其中8批样品达0.95以上。结论:由10批样品生成的对照图谱可以作为重庆垫江药用牡丹刮丹皮的标准指纹图谱,其特征信息提取充分。     

右旋糖酐40葡萄糖注射液细菌内毒素检测方法的研究

目的:探讨右旋糖酐40葡萄糖注射液是否适用于细菌内毒素检查法.方法:采用中国药典2000版附录细菌内毒素检查法.结果:右旋糖酐40葡萄糖注射液对细菌内毒素检测无干扰作用.结论:右旋糖酐40葡萄糖注射液适用于细菌内毒素检查法.     

γ干扰素对宫颈癌治疗性脂肽疫苗抗肿瘤作用的研究

目的：研究γ干扰素对宫颈癌治疗性脂肽疫苗的抗肿瘤作用的影响，并对其作用机制进行探讨。方法：采用细胞毒性试验观察不同剂量γ干扰素对宫颈癌治疗性脂肽疫苗的抗肿瘤作用的影响，采用流式细胞术检测宫颈癌细胞HLA—A2分子和CD54的表达。结果：γ干扰素可剂量依赖性地增强宫颈癌治疗性脂肽疫苗的抗肿瘤作用；同时也增加了宫颈癌细胞HLA—A2及CD54分子的表达。结论：γ干扰素可增强宫颈癌治疗性脂肽疫苗的抗肿瘤作用，其作用机制与其上调宫颈癌细胞表面HLA—A2分子和CD54分子表达有关。     

肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体对人宫颈癌HeLa细胞的凋亡作用

目的 现察不同浓度肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)对宫颈癌HeLa细胞的凋亡作用.方法 2006年于重庆医科大学,采用不同浓度的TRAIL作用于HeLa细胞,采用MTT(噻唑蓝)法检测细胞存活分数AO/EB(丫碇橙/嗅乙啶)双重荧光染色观察凋亡细胞结构;流式细胞仪检测细胞周期及细胞凋亡率.结果 TRAIL作用于HeLa细胞24 h后,TRAIL对细胞生长抑制率及细胞凋亡率具有量效关系;AO/EB双重荧光染色可见到早期、晚期凋亡细胞;流式细胞仅检测有王二倍峰出现;细胞周期发生改变.结论 TRAIL对HeLa细胞生长有抑制作用,并可诱导其凋亡.     

肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体诱导HeLa细胞凋亡的差异蛋白质组分析

目的 比较分析肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TNF-related apoptosis-inducing ligand,TRAIL)诱导人宫颈癌细胞系HeLa细胞凋亡前后蛋白质组中的差异表达蛋白,以进一步了解TRAIL的作用机制.方法 以TRAIL诱导人宫颈癌细胞系HeLa细胞凋亡为模型,用双向电泳技术分离HeLa全细胞蛋白质,MALDI-TOF质谱鉴定,MS-FIit数据库分析,RT-PCR半定量方法检测JNK2的表达.结果 鉴定得到12个明显的差异蛋白点,其中8个蛋白点上调,4个蛋白点下调.JNK2的表达与TRAIL有良好的量效关系.结论 JNKK、MAPKAPK-2、Dip13 beta、SHPS-1、DDBb、JEM-1、Macoilin、Leucine-rich repeat-containing protein 14、Ena/VASP-like protein、PTPase-MEG2,GRB10 adaptor protein、THUMP domain-containing pro-tein 1为TRAIL诱导HeLa细胞凋亡的新的相关蛋白.     

HeLa细胞蛋白质组双向电泳技术的建立

目的:建立和优化HeLa细胞蛋白质组分析所需的样品处理方法和双向电泳技术.方法:用三种不同配方的裂解液提取HeLa细胞中的蛋白质,进行双向凝胶电泳,用Amersham ImageMaster VDS-CL型凝胶成像系统获取凝胶图像,以PDQuest(7.4.0)软件进行比较分析.结果:联合使用硫脲和尿素有利于蛋白质的提取,增加碱性蛋白点的检出数量;广谱蛋白酶抑制剂的使用可大大增加双向电泳可检出的蛋白点数,同时使可检出的碱性蛋白点明显增加.结论:本文建立了HeLa细胞双向电泳分析方法,提高了2-DE图谱中蛋白位点的分辨率和重复性,获得了较为理想、清晰的双向电泳图谱,为其蛋白质组学进一步研究奠定了基础.