胸腺五肽基因转化烟草及其表达的研究

目的研究在烟草中表达胸腺五肽（Thymopentin，TP5）。方法合成TP5基因，构建重组载体pB1121＋TP5，以烟草叶盘为外植体，通过根癌农秆菌介导转染烟草，取卡那霉素抗性植株用PCR方法筛选转染阳性植株及RT—PCR、质谱检测阳性植株叶片外植体中的TP5表达。结果抗性植株整合并表达TP5。结论成功构建了含TP5的植物表达载体pB1121＋TP5，并能在烟草中表达。     

人热休克蛋白70在毕赤酵母中的表达及鉴定

目的在毕赤酵母(pichiapastoris)中高效表达人热休克蛋白70(hHSP70),制备具有天然与hHSP70相同结构和活性的重组hHSP70(rhHSP70)。方法用PCR法自人DNA文库中克隆hHSP70的DNA,构建真核表达载体pPICZα/hHSP70。经核酸测序确证后,电转化毕赤酵母菌株X33。用PCR法筛选Zeocin抗性的转染阳性克隆,Westernblot法鉴定甲醇诱导的培养上清液中的rhHSP70,筛选高表达工程菌。结果经PCR法克隆的hHSP70DNA序列与GeneBank登录的cDNA序列一致。将hHSP70DNA定向插入pPICZα,构建pPICZα/hHSP70真核表达载体并经电转化获得Zeocin抗性的转染阳性克隆。SDSPAGE和Westernblot分析显示了甲醇诱导的培养基上清中含有rhHSP70,分子量72kD。氨基酸序列分析证实rhHSP70氨基端15个氨基酸与天然rhHSP70完全一致。rhHSP70表达量高达250mg·L-1。结论获得高效表达rhHSP70的毕赤酵母工程菌。