氧化石墨烯促进HaCaT细胞迁移及初步机制研究

目的 观察氧化石墨烯(grapheneoxide,GO)对人表皮细胞株HaCaT细胞迁移的影响,初步探讨其可能机制.方法 将HaCaT细胞分别应用GO终浓度为0、0.001、0.01、0.1、1.0、10.0 μg/mL的RPMI 1640细胞培养液培养,在培养的不同时相点,应用CCK-8法检测细胞活性,蛋白印迹法检测PCNA表达.采用划痕实验检测细胞迁移情况,激光共聚焦显微镜观察细胞骨架改变,蛋白质印迹法检测细胞F-actin、Vinculin的表达.结果 (1)低浓度GO对HaCaT细胞增殖无影响,当GO浓度高于1.0 μg/mL时则具有明显的毒性作用.10.0 μg/mL GO可明显抑制细胞PCNA表达(P＜0.05).(2)划痕实验结果显示:低浓度GO可促进HaCaT细胞迁移,其中以0.01 μg/mL浓度效果最明显,在划痕后24 h,该组细胞迁移面积比对照组增加35.33％ (P ＜0.01).(3)激光共聚焦显微镜观察发现,0.01μg/mL GO刺激后,细胞纤毛明显增多,胞内应力性纤维增粗.而其1.0 μg/mL组细胞变小、变圆.(4)蛋白印迹法检测结果显示:0.01μg/mL GO刺激后F-actin表达增加(P＜0.05),而1.0μg/mL作用后F-actin表达却明显低于对照组.GO能促进Vinculin表达,但仅当GO浓度高于0.1 μg/mL后差异才有统计学意义.结论 特定浓度的GO可促进HaCaT细胞迁移,可能与其影响细胞骨架及F-actin、Vinculin表达有关.     

人CTLA-4胞外区cDNA毕赤酵母表达载体的构建及高拷贝稳定整合菌株的筛选

目的 构建人CTLA－4胞外区蛋白毕赤酵母分泌型表达载体，获得高拷贝稳定整合菌株，为大量获得人CTLA－4胞外区蛋白，进行功能研究及其临床应用奠定基础。方法 从活化人外周血淋巴细胞总RNA中，扩增人CTLA－4基因胞外区cDNA片段，将目的基因插入酵母表达载体pPIC9α分泌信号下游，再插入高拷贝载体pPIC9K，得到pPIC9K-CTLA4,SaL I线性化后电转GS115；G418梯度筛选转化菌。PCR，Suthern blotting鉴定目的基因整合及拷贝数。结果 成功构建了人CTLA－4胞外区cDNA毕赤酵母表达载体，获得了高拷贝稳定整合菌株。结论 为表达人CTLA－4胞外区蛋白及其功能研究和临床应用奠定了基础。     

人CTLA4胞外区突变体在毕赤酵母中的高效表达

目的 根据毕赤酵母密码子偏好，设计并改造人CTLA4胞外区cDNA，构建毕赤酵母分泌型表达载体，以实现人CTLA4胞外区蛋白在毕赤酵母中的高效表达。方法 利用PCR定点突变技术，将人CTLA4胞外区cDNA中的毕赤酵母低频使用密码子突变成高频使用密码子而不改变其氨基酸序列；经DNA序列测定证实后插入毕赤酵母高拷贝表达载体pPIC9Ka分泌信号下游，SacⅠ线性化后电转GS115；G418梯度筛选转化菌；PCR鉴定目的基因整合；甲醇诱导表达，SDS-PAGE、Westem blotting、肽质量指纹等鉴定表达蛋白。结果 成功地对人CTLA4胞外区cDNA进行了定点突变，该突变体在毕赤酵母中能成功表达CTLA4胞外区蛋白。结论 为高效表达人CTLA4胞外区蛋白及其功能研究和临床应用奠定了基础。     

大鼠树突状细胞的体外分离、纯化、扩增及鉴定

目的 探讨诱导及纯化大鼠树突状细胞（Dendritic cells,DC）的方法，为进一步研究树突状细胞的功能、特性及临床应用提供技术方法。方法 应用重组大鼠rGM-CSF、IL－4在体外培养大鼠骨髓前体细胞获得大量DCs，经标抗大鼠OX62单抗免疫磁株分离纯化后的DCs经形态学观察、表型检测、功能学实验鉴定。结果 大鼠骨髓来源的DC在体外培养12－14d后完全成熟，99．36％培养纯化后DC表达大鼠特异性表面标志OX62；典型的成熟大鼠DC形态上类似于小鼠和人类的DC，表型为MHCⅡ＋＋，OX62＋＋，FcγR（CD32）＋／－，CD80＋／－，CD86＋＋，体外功能分析显示该DC能够强烈刺激MLR并有效递呈可溶性抗原OVA刺激初始型T细胞的增殖。结论 成功地建立了体外大量扩增大鼠骨髓DC的方法，为研究其在异种移植及诱导免疫耐受的作用打下基础。     

CTLA4Ig诱导免疫耐受的体外研究

目的 观察CTLA4Ig在诱导人外周血T细胞免疫耐受中的作用。方法 以结核菌素刺激人外周血淋巴细胞，观察不同剂量CTLA4Ig对外周血淋巴细胞增殖反应的影响；观察CTLA4Ig和CsA(环孢霉素A)对再次结核菌素刺激和非相关第三者APC细胞刺激淋巴细胞增殖反应的影响，IL-2的变化，以及外源性IL-2对免疫耐受诱导的影响。结果 CTLA4Ig抑制淋巴细胞增殖呈剂量依赖关系，20μg／ml时抑制作用最强；CTLA4Ig能诱导免疫耐受并与CsA有协同作用；外源性IL-2能抑制免疫耐受的诱导。结论 CTLA4Ig能抑制淋巴细胞的增殖和IL-2的分泌释放，CTLA4Ig和CsA联合应用能更彻底抑制淋巴细胞增殖和IL-2的分泌释放，并诱导免疫耐受；外源性IL-2能逆转免疫耐受。     

人CD4+CD25+T细胞和CD4+CD25-T细胞蛋白质组的双向电泳分析

目的 用双向电泳技术分析人CD4^ CD25^ T细胞和CD4^ CD25^-T细胞表达的蛋白质组，建立二者之间的差异表达谱。方法 从人脾脏分选CD4^ CD25^ T细胞和CD4^ CD25^-T细胞，用双向电泳技术分析两种细胞蛋白质组的表达差异。结果 分选细胞纯度分别为CD4^ CD25^ T细胞82.3%,CD4^ CD25^-T细胞96.5%，双向电泳分析发现有4个蛋白点明显仅于CD4^ CD25^ T细胞检测到表达，有9个蛋白点明显仅于CD4^ CD25^-T细胞检测到表达。结论 CD4^ CD25^-T细胞和CD4^ CD25^-T细胞表达蛋白质组有明显差异。     

以Bacmid-杆状病毒系统表达人CTLA4胞外区蛋白的研究

目的 在Bacmid-杆状病毒-昆虫细胞系统中表达人CTLA4。方法 采用PCR技术，自pUC19-CTLA4Ig质粒中获取人CTLA4胞外区cDNA，将其克隆人pFastBacl质粒中，经DNA自动测序仪进行DNA序列鉴定，并进一步将其转座人Bacmid中，在昆虫细胞HzAM1中进行表达，采用SDS-PAGE对表达产物进行分析。结果 在昆虫细胞表达系统中表达出完全糖基化的人CTLA4胞外区重组蛋白。结论 人CTLA4胞外区cDNA在Bacmid-杆状病毒，昆虫细胞系统中得到了表达。     

肾移植大鼠慢性排斥反应模型的建立

目的:建立一种方便、实用的慢性器官移植排斥反应模型,为研究器官移植后慢性排斥反应的发病机制、预防和治疗提供平台。方法:以近交系F344大鼠和近交系Lewis大鼠作为供、受体,取供体的双肾作为供肾,借助静脉支架管,行供体的静脉与受体肾静脉的端端吻合,肾动脉与腹主动脉行端侧吻合。施行原位异体肾移植。移植后即给与环孢素腹腔注射。并于术后4周后行病理检查。结果:所有手术均于60min内完成。所有的受体均存活超过60天,围手术期死亡数为零。受体无急性排斥反应发生。4周后可见典型的慢性排斥反应发生。结论:建立了大鼠慢性排斥反应肾移植模型。为研究慢性排斥反应的发生、进展和干预治疗提供了良好的平台。     

皮秒脉冲固体激光对乳猪皮肤组织的气化效应

目的 探索1 064 nm波长皮秒(ps)脉冲Nd∶YAG激光对乳猪皮肤组织的气化效应及气化区周围的热凝固效应.方法 使用脉宽30 ps,频率10 Hz,最大单脉冲能量100 mJ的1 064 nm脉冲Nd∶YAG激光照射离体乳猪皮肤组织,按照单脉冲能量0、20、40、60、80 mJ和100 mJ,每次辐照时间分别为2、5 s和10 s进行分组,组合形成18组激光剂量,每组3个标本.使用超景深显微镜即时观察记录气化区深度及宽度.取受照皮肤组织制作组织切片,HE染色,显微镜下观察测量气化区外围凝固区宽度.根据所得数据绘制单脉冲能量及辐照时间与气化区宽度、深度及凝固区宽度的量效关系曲线,分析其作用规律及临床意义.结果 气化区直径为740.66～1 455.32(1 168.85±188.57) μm,气化区深度106.44 ～1 314.80(412.16 ±289.84)μm;凝固区宽度65.35 ～238.73(141.10 ±47.68) μm.结论 1 064 nm波长30 ps脉宽Nd∶YAG激光对乳猪皮肤组织有较强的气化作用,且气化作用的效应程度与单脉冲能量和每次辐照时间呈正相关趋势.用该激光气化目标皮肤组织时,对健康组织热凝固效应可控制在百微米级范围.