鸡法氏囊B淋巴细胞三框cDNA表达文库的构建

分离纯化3周龄SPF鸡法氏囊B淋巴细胞的mRNA,以5'端生物素标记的Oligo(dT)primer为引物反转录后连接3种读码框的Adapter,层析柱分级纯化,通过BP重组反应分别构建3种读码框的cDNA入门文库,平均滴度分别为1×105 CFU/mL、1×105CFU/mL、1.2×105CFU/mL,文库总容量分别为1.2×106CFU、1.2×106CFU、1.5×106CFU,平均插入片段分别为1 270 bp、1 190 bp和1 120 bp,阳性重组率均为100%.将3种读码框的cDNA入门文库扩增后提取质粒,取等量的质粒通过LR重组反应将入门文库转换为三框表达文库,经测定平均滴度为1×105CFU/mL,文库总容量为1.2×106CFU,平均插入片段为1 017 bp,阳性重组率为100%.结果表明所构建的三框cDNA表达文库具有较高的重组率和较大的库容量,为进一步筛选鸡传染性法氏囊病病毒(IBDV)在法氏囊B淋巴细胞中的受体及研究细胞嗜性奠定了基础.     

丝状支原体丝状亚种SC型中国分离株LppB基因的克隆与序列分析

牛传染性胸膜肺炎（CBPP）是OIE公布的一类烈性传染病，死亡率在30％-80％之间。在19世纪，CBPP在世界很多地区呈地方流行，非洲至今仍地方流行。在20世纪上半叶，北美、澳大利亚、欧洲宣布消灭了CBPP，但近20年间南部欧洲重新发现CBPP流行。根据流行病学和临床观察，在欧洲暴发的CBPP的致死率要比发生在非洲的CBPP低。     

某海兰褐鸡场祖代、父母代及商品代鸡血管瘤型ALV-J的分离与鉴定

从山东省某海兰褐鸡场祖代、父母代种鸡和商品代蛋鸡中获得疑似血管瘤型禽白血病(Avian leukosis,AL)病料.采用病理剖检、IFA、分子生物学检测,确定为J亚群禽白血病.从祖代、父母代病料中各分离到1株J亚群禽白血病病毒(J subgroup of avian leukosis virus,ALV-J),从商品代蛋鸡中分离到4株ALV-J.根据原型毒株HPRS103设计1对gp85基因引物,获得gp85基因序列.获得的gp85基因序列与各亚群参考毒株序列核苷酸同源性比对,结果显示:分离自商品代蛋鸡的Commercial03株、Commercial04株、Commercial06株和父母代分离株Parent02株位于同一分支,同源性在97.2％～97.9％,与HPRS103株同源性94.7％～95.2％;Commercial05株与祖代分离株Grandparent01株在同一分支,与HPRS103株同源性为98.3％,4株分离自商品代的ALV-J同源性为95.0％～99.9％.表明商品代蛋鸡中的ALV-J可能来自父母代或祖代种鸡的垂直传播,也可能来自于其他来源的水平传播.从同一鸡场祖代、父母代及商品代鸡中分离得到ALV-J,这在我国还是首次.对后续研究其基因突变、致瘤机制等奠定了良好的基础.     

烟草抗TMV基因连锁分子标记的筛选及在抗病资源筛选中的应用

以抗TMV品种Coker176和感TMV品种K326为亲本,经杂交、自交获得F2作图群体.通过SRAP、SSR、N基因特异引物等分子标记分析结合田间TMV抗性鉴定,将TMV抗性基因定位于LG1连锁群上.TMV抗性基因位点位于标记N2和XSRP1x26之间,遗传距离分别是4.3 cM和9.6 cM.利用N2标记对84份烤...     

烟碱合成分子调控研究进展

烟碱由一个吡咯环和一个吡啶环构成,是栽培烟草中最重要的生物碱,占总生物碱含量的90%～95%。烟碱合成途径除最后一步聚合反应仍需试验证实外已基本明确,主要途径基因已被克隆。近年来,烟碱合成调控机制研究进展迅速,多个调控基因被发现参与调控烟碱的合成。文中对烟碱合成途径及其合成调控因素、参与合成调控的转录因子等方面进行了综述,并对烟碱合成调控的未来研究发展进行了展望。     

葡萄起垄栽植早期丰产栽培试验

起垄栽植,不仅能够节约土方、肥料、农药、人工管理费等投资成本,一次性投资小,而且能快速有效地聚集吸收表土的养分,使根系生长活跃,加速叶片碳水化合物的积累,提早开花结果,缩短童期2 a,第2 a葡萄每667 m2平均产量达1 419 kg,比对照增加6.2倍,第3 a葡萄每667 m2平均产量达1 815 kg,比对照增产1.4倍,增产效果显著,提高了种植者的信心。     

鸡传染性贫血病毒VP3基因的原核表达及抗血清制备

为了研究鸡传染性贫血病毒(Chicken anemia virus,CIAV)VP3蛋白与病毒自身蛋白之间的相互作用,需对该蛋白进行原核表达制备相应兔源抗血清,试验通过提取CIAV M9905株基因组DNA,PCR扩增出VP3基因,构建重组质粒pET30a(+)-VP3,然后转化入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中,进一步通过IPTG诱导表达后用Ni-NTA亲和柱纯化获得融合蛋白,经SDS-PAGE分析后对融合蛋白进行乳化,免疫新西兰兔制备抗血清,并对其进行ELISA效价测定、Western-blot及IFA检测。结果表明:SDS-PAGE分析证实获得高纯度的重组蛋白VP3,大小约为22 ku,且其在大肠杆菌中主要以包涵体的形式存在;ELISA法检测制备的兔源抗VP3血清效价在1∶6 400以上;经Western-blot及IFA检测证实,VP3兔源血清可特异性结合Vero细胞表达的VP3蛋白。说明试验成功表达出CIAV VP3蛋白,制备的兔抗血清具有较好的特异性。     

鸡传染性法氏囊病病毒超强毒株VP2基因突变对细胞嗜性改变的研究

为研究鸡传染性法氏囊病病毒超强毒株(vvIBDV)细胞嗜性改变的分子基础,本研究通过定点突变、重叠延伸PCR(SOE-PCR)等技术,以vvIBDV HLJ-0504株为骨架构建了两组感染性克隆,并借助已建立的反向遗传操作技术进行病毒拯救。IFA检测、电镜观察及RT-PCR鉴定均显示:Q253H/A284T双点突变的pCAGGHLJ0504A889/980HRT和pCAGGHLJ0504BHRT共转染DF1细胞成功拯救出重组病毒(rHLJ0504HT),而未进行双点突变的pCAGGHLJ0504AHRT和pCAGGHLJ0504BHRT共转染组未获得重组病毒。上述结果表明,双点突变Q253H/A284T能使vvIBDV HLJ-0504适应非允许细胞CEF,但未进行Q253H/A284T双点突变的vvIBDV HLJ-0504不能感染非允许细胞CEF,因此,该研究表明VP2的Q253H/A284T两个氨基酸突变是vvIBDV细胞嗜性改变的分子基础。     

禽网状内皮组织增生症病毒env基因的原核表达及其多克隆抗体制备

为原核表达禽网状内皮组织增生症病毒(REV)env蛋白及制备抗env蛋白的高效价多克隆抗体,本研究以pMD18T-env(HLJR0901株)为模板,扩增得到REV的env全长基因,将其克隆于pET-32a(+)中。将阳性重组质粒pET-env转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导表达。利用亲和层析纯化重组蛋白,复性后免疫BALB/c小鼠,制备抗env多克隆血清。SDS-PAGE及western blot结果表明,env基因以融合蛋白形式获得正确表达,相对分子质量约为84ku,表达产物具有良好免疫原性;IFA结果显示,制备的抗env多克隆血清能与REV野毒株特异性反应;ELISA效价达到1∶105以上。该研究为REV的检测及env蛋白的深入研究奠定了基础。     

鸡传染性法氏囊病病毒超强毒株HLJ-0504 VP5基因缺失株感染性克隆的构建及鉴定

利用体外定点突变技术,缺失vvIBDV HLJ-0504株VP5基因,通过多重PCR在基因组两端分别引入锤头状核酶序列（HamRz）和丁肝病毒核酶序列（HdvRz）。将带有核酶序列的IBDV基因组插入载体pCAGGs的β肌动蛋白启动子下游,构建了IBDV感染性克隆pCAGGHLJ0504A△VP5HRT,将该感染性克隆与pCAG—GHLJ0504BHRT共转染DF—Ⅰ细胞。IFA,RT—PCR,电镜观察均显示获得重组病毒,将其命名为rHLJ0504HT△VP5。vvIBDVVP5基因缺失感染性克隆的成功构建为我们利用反向遗传操作技术快速致弱vvIBDV,构建IBD的候选疫苗株奠定了基础。