表达绿色荧光蛋白重组单核细胞增多性李斯特菌的构建

将编码绿色荧光蛋白(GFP)的基因融合到单核细胞增多性李斯特菌actA基因启动子和信号肽下游,应用同源重组技术构建了含gfp的重组李斯特菌突变株.PCR扩增及其产物的酶切鉴定均证实目的基因gfp融合到李斯特菌基因组中.荧光显微镜下可见重组菌体发绿色荧光.SDS-PAGE电泳和免疫印迹结果显示重组李斯特菌表达的GFP分子量约为28 kD,与预计的分子量大小一致.重组菌对鸡胚和小鼠的毒力以及对体外培养细胞的侵袭力均低于野生型李斯特菌.该重组菌可用于研究李斯特菌的致病机理和食品加工过程中微生物污染控制的指示性细菌.     

猪圆环病毒2型和3型双重荧光定量PCR检测方法的建立

为建立一种同时检测猪圆环病毒2型(PCV2)和猪圆环病毒3型(PCV3)的方法,参照GenBank上已登录的PCV2 Cap基因和PCV3 Cap基因的保守序列,设计特异性引物和TaqMan探针,通过优化反应条件,建立了同时检测PCV2和PCV3的双重荧光定量PCR检测方法,并对其进行特异性、灵敏性、可重复性检验.特异...     

猪繁殖与呼吸综合征病毒17-ZJ-HZ毒株的分离鉴定与分子流行病学分析

杭州某猪场断奶仔猪群出现高热、呼吸困难等症状,疑似猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)感染,3头病猪肺脏病变样本送本实验室检测,通过RT-PCR方法检测其病原核酸。肺脏匀浆液无菌处理接种到MARC-145细胞,细胞病变观察、Western-blot、间接免疫荧光等方法验证PRRSV病毒分离情况;RT-PCR方法分五段扩增获得全长病毒基因组序列,采用MEGA等软件分析该毒株的核苷酸序列以及GP5、NSP2氨基酸序列;分离病毒接种3日龄PRRSV阴性仔猪,评价该病毒的毒力。结果表明:该场送检样品为PRRSV阳性;成功分离得到17-ZJ-HZ病毒;获得15 325 bp的 PRRSV全基因组序列。序列分析表明,该毒株与经典北美株的NSP2存在典型的29+1个氨基酸的缺失,且进化分析归于HP-PRRSV亚群。攻毒60 h后猪只出现典型的PRRSV临床症状和病理变化,以上结果表明该毒株为高致病性PRRSV(highly pathogenic PRRSV, HP-PRRSV)的北美株。     

高等学校动物医学类计量认证实验室运行机制探析

为了提高高校计量认证实验室检测能力和人才培养质量,探索高校实验室管理和计量认证体系的质量管理结合机制,本文依托浙江农林大学动物健康检测中心的实践经验,围绕本科生毕业论文、本科生实验教学、实验室规范管理等方面形成了检测质量控制和人才培养的创新模式,供高校其他实验室借鉴,以期有利于提高高校实验室的管理水平,促进本科生人才培养质量的提升。     

产气荚膜梭菌主要毒力因子的分子生物学研究进展

产气荚膜梭菌(Clostridium aerogenes capsulatus)又名镶边梭菌(C.Perfringens)、魏氏梭菌(C.Welchii),为一类G+产芽胞的厌氧杆菌.其致病作用一般由它产生的胞外酶或毒素诱导.最重要的就是α-毒素和θ-毒素.此外,其它的一些胞外酶,如胶原酶E(κ毒素)、透明质酸酶(μ-毒素)DNA酶(v-毒素)和神经节苷酶(唾液酸酶)的病理作用也已经阐明.人和动物食物中毒主要与该菌在芽胞形成过程中产生的一种芽胞相关蛋白(肠毒素)有关.随着产气荚膜梭菌分子生物学领域的飞快发展,各种主要毒素和肠毒素基因均已克隆成功.本文重点针对产气荚膜梭菌α-毒素、θ-毒素、神经节苷酶以及肠毒素和芽胞形成的分子机制等方面的研究进展作一综述.     

LA-PCR快速克隆传染性法氏囊病病毒基因组A节段全长cDNA方法的建立

从浙江省某鸡场暴发疑似传染性法氏囊病 (IBD)的法氏囊病料中分离到 1株致死率高达 70 %的强毒株 (IBDV-ZJ2 0 0 0 )。通过筛选 ,采用效果最理想的蛋白酶 K法从法氏囊中提取病毒基因组 RNA,经 L i Cl纯化后 ,优化各种反应参数和条件 ,建立了 L ong- accurate PCR(L A- PCR)一步直接扩增 IBDV A节段全长 c DNA的方法 ,得到一约 3.2 6 kb的片段。L A- PCR法能快速从病鸡法氏囊和细胞适应毒中扩增 A节段全长 c DNA,为研究各 IBDV毒株 A节段的结构和功能打下了基础。     

传染性法氏囊病免疫失败原因分析

传染性法氏囊病 (IBD)是由传染性法氏囊病病毒 (IBDV)引起的一种急性、高度接触性传染病。IBD疫苗的使用 ,曾使本病一度得到控制 ,但进入 80年代中期后 ,由于 IBDV变异株和超强毒 (vv IBDV)的出现 ,经常导致免疫失败。虽然各国学者在 IBD疫苗的研究上取得了巨大成就 ,均未能从根本上扭转IBD流行日趋严重的现状 ,这可能与各地本病的流行病学、IBD疫苗本身质量、疫苗毒株的特点、疫苗的选择、鸡群的母源抗体、管理条件等诸多因素紧密相关 ,本文就 IBD免疫失败原因及机制做一探讨。1　 IBDV变异株和 vv IBDV与免疫失败1985年 ,…     

猪传染性胃肠炎病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

针对猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)S基因的保守序列设计引物,以TEGV疫苗毒株为模板,克隆S基因,并构建重组阳性质粒,优化反应体系和扩增条件,建立基于SYBR GreenⅠ染料的实时荧光定量PCR检测方法,并对其特异性、重复性和灵敏度进行分析。结果显示:建立的检测方法灵敏度可达10拷贝/μL,标准曲线线性关系良好(r=0.997),扩增效率高,具有良好的特异性和重复性。使用该方法对124份临床疑似TGEV病料进行检测,阳性样本有17份,检测样本的阳性率为13.7%。该方法可用于兽医临床上TGEV的快速检测和流行病学分析。     

AIM2炎症复合体活化体系的体外构建及初步应用

AIM2炎症复合体参与自身免疫性疾病和机体抵御病原体的过程,研究其激活机制具有重要的意义。为构建AIM2炎症复合体的体外活化体系,本研究通过PCR方法从人单核细胞(THP-1细胞)中扩增AIM2、ASC、pro-Caspase-1、 pro-IL-1β基因片段后,构建重组质粒p3×Flag-AIM2、 p3×Flag-ASC、 p3×Flag-pro-Caspase-1和p3×Flag-pro-IL-1β,分别转染HEK293T细胞后采用western blot鉴定各蛋白的表达。结果显示,分别约在41.9 ku、34.1 ku、 48.5 ku、 24.6 ku处出现特异性条带,表明融合Flag标签的AIM2、 ASC、 Caspase-1和IL-1β蛋白在HEK293T细胞中获得了表达。除此之外,还可以在HEK293T细胞中检测到39 ku的内源性AIM2蛋白特异性条带,表明HEK293T细胞自身也表达内源性AIM2蛋白。将不同浓度比例的上述重组质粒转染或共转染HEK293T细胞,24 h后各组再转染poly(dA:dT),采用间接ELISA检测各组细胞中IL-1β的分泌水平。结果显...     

镉致肝损伤机制及硒拮抗镉肝毒性的研究进展

镉是一种有毒重金属,能通过食物链蓄积于机体内,造成急性或慢性中毒,严重威胁人类和畜禽的健康。肝是镉毒性损伤的主要靶器官,揭示镉的肝毒性机制以及如何抑制其毒性作用具有重要意义。硒是人体必需的微量元素之一,在维持机体正常生命活动中具有重要作用,近年来,很多研究表明硒能够拮抗镉的肝毒性。本文主要对镉致肝毒性损伤机制以及硒拮抗镉肝毒性的相关研究报道进行归纳总结,以期为镉污染的防治以及硒的临床应用提供参考。