急性早幼粒细胞白血病PML-RARα融合基因异构体cDNA实时定量PCR标准品及标准曲线的构建

目的克隆急性早幼粒细胞白血病PML-RARα融合基因异构体L型、S型cDNA作为实时定量聚合酶链反应(FQ-PCR)检测PML-RARα融合基因的标准品,从而构建FQ-PCR检测标准曲线。方法应用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)从急性早幼粒白血病患者骨髓单个核细胞的总RNA中逆转录扩增的PML-RARα融合基因异构体L型、S型cDNA,将纯化的PML-RARα融合基因异构体L型、S型cDNA与pMD18-T载体进行连接,转化宿主菌E.coli DH5a感受态细胞,氨苄青霉素培养基筛选阳性克隆,提取重组质粒cDNA用限制性核酸内切酶HindⅢ、EcoRⅠ进行双酶切鉴定并测序分析,最后进行实时荧光定量PCR检测。通过检测重组质粒260 nm吸光度,确定原液的重组质粒拷贝浓度并以此制备荧光定量PCR标准品。结果酶切鉴定、PCR扩增及测序分析均证实PML-RARα融合基因重组到pMD18-T载体。结论成功克隆急性早幼粒白血病PML-RARα融合基因异构体L型、S型cDNA。     

TFPI-2对K562细胞体外生长和侵袭能力的影响

目的研究组织因子途径抑制物-2（TFPI-2）基因对白血病细胞系K562细胞生长和侵袭的影响。方法通过脂质体法将TFPI-2基因转染到K562细胞,用实时定量RT—PCR和Western blot分别检测转染前后TFPI-2mRNA和其蛋白质的表达。生长曲线测定,平板克隆和（Transwell）小室穿透实验测定转染前后3组细胞生长、恶性增生能力以及体外侵袭能力的差异。结果转染成功TFPI-2基因的K562细胞（K562-T）有TFPI-2mRNA及其蛋白质的表达,与对照组K562组、K562-V组细胞相比,K562-T细胞生长速度缓慢,克隆形成率明显低于前2组（P〈0．05）,有统计学意义;其穿膜细胞数（16±4．51）明显低于前两者（33．67±4．51）及（28．67±3．51）,P〈0．05,有统计学意义。结论TFPI-2基因对K562细胞的生长和侵袭能力有抑制作用。     

地中海贫血筛查指标的临床应用价值

目的探讨地中海贫血筛查指标的临床应用价值。方法采用红细胞脆性、平均红细胞体积(MCV)、血红蛋白电泳筛查地中海贫血可疑病例,并对可疑病例进行地中海贫血基因诊断和血清铁蛋白检查。结果①从3644例受检者中筛查出636例可疑地中海贫血患者,红细胞脆性、MCV、HbA2三者检出率分别为17.5%、17.1%、7.1%;可疑地中海贫血患者中,红细胞脆性<70%、MCV<80fL、HbA2≥3.5%的患者分别为100%、97.8%、40.4%。②可疑地中海贫血患者中,红细胞脆性<65%组与脆性为65%～70%组比较,地中海贫血基因诊断符合率差异有统计学意义(P<0.05),但后组基因诊断符合率仍然高达54.3%。③可疑地中海贫血患者中,MCV<80fL组与MCV≥80fL组比较,HbA2≥3.5%且MCV<80fL组与HbA2≥3.5%且MCV≥80fL组比较,地中海贫血基因诊断符合率差异无统计学意义(P>0.05)。④可疑地中海贫血患者中确诊缺铁性贫血、地中海贫血、地中海贫血合并缺铁性贫血比例分别为16.3%、67.0%、16.7%,地中海贫血筛查的特异性为83.7%。结论①红细胞脆性<70%是地中海贫血筛查最敏感简便的指标,宜作为产前检查地中海贫血筛查指标。②MCV<80fL是地中海贫血筛查的简便指标,但需要结合红细胞脆性、HbA2等红细胞参数提高检出率。③对筛查出的可疑地中海贫血患者必须同时进行地中海贫血基因检查和铁代谢检查。     

常规剂量rhG-CSF动员无关供者外周血造血干细胞的效果观察

目的观察5μg/(kg·d)的rhG -CSF对20名无关供者外周血造血干细胞动员效果。方法rhG -CSF5μg/(kg·d)连续5d皮下注射,第4.5天、5.5天用CS3000血细胞分离机分2次采集外周血造血干细胞。结果动员第4.5天,MNC和CD34+细胞达高峰,第5.5天略有下降。第4.5天和5.5天采集产品的MNC分别为(324.3±67)×108个和(257.3±46.2)×108个,CD34+细胞数分别为(272±102)×106个和(201.5±79.4)×106个。所有受者均获满意的造血重建,而捐献者均未见明显的并发症。结论5μg/(kg·d)rhG- CSF动员外周血干细胞安全可靠。     

混合系白血病基因重排的检测方法及其临床意义

为了研究混合系白血病（MLL）基因重排在急性白血病（AL）中的发生率、融合基因类型及其临床意义，用荧光原位杂交技术检测60例急性白血病（AL）患者MLL基因重排，对于MLL基因重排阳性的患者，用巢式RT—PCR方法检测MLL基因重排形成的6种常见融合基因类型。结果表明：7例AL患者有MLL基因重排，发生率为11．67％，其中2例为急性髓细胞白血病M5（AML—M5），融合基因均为MLL／AF9；男5例为B细胞系急性淋巴细胞白血病（B—ALL），其中2例融合基因为MLL／ENL，1例MLL／AF4，2例未扩增出融合基因产物。结论：荧光原位杂交技术是检测ALMLL基因易位重排的快速、特异、灵敏的方法，巢式RT-PCR是检测MLL基因重排产生的融合基因类型的简便可行的方法；MLL基因重排的检测对急性白血病预后判断和治疗方案的选择具有重要意义。     

采用减量Bu/Cy+ATG方案进行异基因造血干细胞移植治疗恶性血液病

目的 探讨使用低强度Bu/Cy ATG预处理方案进行异基因造血干细胞移植治疗恶性血液病的疗效.方法 采用减低剂量的Bu/Cy ATG方案,进行异基因造血干细胞移植治疗18例恶性血液病,预处理方案是:马利兰(BU)4 ms/(ks·d)×3,环磷酰胺(CY)60 ms/(kg·d)×2,司莫司汀(Me-CCNU)450 Ing/(m2·d)×1,抗胸腺细胞球蛋白(ATG)3 ms/(kg·d)×2.采用环孢素A 霉酚酸酯(MMF) 短程MTX预防GVHD.结果 18例患者重建造血,中位随访时间22(3～40)个月,18例中无病存活10例,死亡8例,缓解期移植患者的存活率达66.7%.结论 低强度的Bu/Cy预处理方案,移植相关毒性减小,该方法治疗恶性血液病安全可行.     

g562／AS2细胞株对三氧化二砷耐药机制的初步研究

目的：研究K562／AS2细胞株对三氧化二砷（ATO）耐药的机制。方法：采用MTT法检测细胞毒性。细胞表面P-糖蛋白（P—gP）、细胞内柔红霉素（DNR）浓度采用流式细胞术检测。DNA聚合酶、拓扑异构酶Ⅱ（TopoⅡ）、多药耐药基因1（mdr1）、多药耐药相关蛋白1（MRP1）以及肺耐药相关蛋白基因（lrp）表达水平的检测采用RT—PCR法。结果：K562和K562／AS2细胞表面P—gP任意荧光强度、K562／AS2细胞内DNR浓度均无显著差异（P〉0．05）。K562／AS2细胞株MRPⅠ和TopoⅡ表达明显高于K562细胞（P〈0．05），DNA多聚酶，mdr1和lrp表达与敏感细胞株K562细胞相同（P〉0．05）。结论：ATO耐药细胞K562／AS2高表达MRP1，并产生低倍数的多药耐药。K562／AS2细胞TopoⅡ基因表达增高，其意义有待进一步阐明。     

伏立诺他与左旋苯丙氨酸氮芥对人类多发性骨髓瘤细胞的协同作用

 目的　观察体外伏立诺他和左旋苯丙氨酸氮芥联合对人类多发性骨髓瘤细胞株U266、KM3的抗瘤作用。方法　应用MTT法分别测定伏立诺他和左旋苯丙氨酸氮芥不同浓度对骨髓瘤细胞株U266、KM3的抗瘤作用,计算两药的IC50值;应用MTT法测定固定一种药物浓度联合不同浓度另一药物时对U266、KM3的抑制作用,计算药物联合指数（CI）,判断药物相互作用。 结果　伏立诺他单药对U266细胞的IC50值介于5.0～7.5 μmol／L,对KM 3细胞的IC50值介于2.5～5.0 μmol／L;左旋苯丙氨酸氮芥单药杀伤U266细胞的IC50值介于40～60 μmol／L,杀伤KM3细胞的IC50值介于60～80 μmol／L。固定伏立诺他浓度（U266细胞中为1.25 μmol／L,KM 3细胞中浓度为1.0 μmol／L）,在U266细胞中左旋苯丙氨酸氮芥浓度为20、40、60、80 μmol／L时均CI＜0.9,表现为协同作用,在KM3细胞中左旋苯丙氨酸氮芥浓度为40、60、80、100 μmol／L时均CI＜0.9,表现为协同作用;固定左旋苯丙氨酸氮芥浓度（U266细胞中为10 μmol／L,KM3细胞中浓度为20 μmol／L）,在U266细胞中伏立诺他浓度为2.5、5.0、7.5 μmol／L时均CI＜0.9,表现为协同作用,在KM3细胞中伏立诺他浓度为1.0、2.5、5.0 μmol／L时均CI＜0.9,表现为协同作用;当伏立诺他浓度为7.5 μmol／L联合左旋苯丙氨酸氮芥20 μmol／L时呈现相加作用（CI＝0.93）。结论　体外伏立诺他单药对两种多发性骨髓瘤细胞株有明显的杀伤作用,与左旋苯丙氨酸氮芥有协同抗骨髓瘤细胞作用。     

组织因子途径抑制物-2影响多发性骨髓瘤血管内皮生长因子表达的研究

目的 研究组织因子途径抑制物-2（TFPI-2）基因对多发性骨髓瘤（MM）细胞血管内皮生长因子（VEGF）表达的影响。方法 通过脂质体转染技术将pcDNA3.0/TFPI-2或pcDNA3.0导入多发性骨髓瘤细胞株，分别设为实验组和对照组，用ELISA法测定实验组和对照组上清液中VEGF水平以及骨髓基质细胞(BMSCS)与实验组和对照组细胞共同培养分泌的VEGF蛋白的差异，以实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应(RQ-PCR)法测定实验组和对照组细胞内VEGF mRNA的表达。结果 实验组VEGF、细胞内VEGF mRNA的表达未见明显差异，实验组与骨髓基质细胞共同培养的VEGF水平低于对照组。结论 TFPI-2基因可能间接抑制BMSCS产生和分泌VEGF