视黄酸缺乏对斑马鱼心脏房室分化的影响

目的 通过化学遗传学方法建立视黄酸缺乏的斑马鱼模型,探讨视黄酸缺乏对斑马鱼胚胎心脏前后轴发育即房室分化的影响.方法 在斑马鱼胚胎孵育的5 hpf,用不同浓度梯度的视黄醛脱氢酶2抑制剂DEAB(1×10-6、5×10-6、10×10-6、25×10-6 mol/L)处理斑马鱼胚胎,实时观察斑马鱼胚胎发育的全过程.通过给予斑马鱼胚胎外源性视黄酸,观察其对DEAB的拮抗作用.应用胚胎整体原位杂交观察视黄酸缺乏对心脏特异基因vmhc和amhc表达的影响.结果 斑马鱼胚胎的生存率随着DEAB处理浓度的增加而降低,当DEAB浓度≥5×10-6 mol/L时,斑马鱼的畸胎率达100%.5×10-6 mol/L DEAB的致畸作用能够被1×10-9mol/L外源性视黄酸所拮抗.整体原位杂交结果显示视黄酸缺乏会导致斑马鱼胚胎心脏房室分化异常,表现为vmhc表达细胞的范围增大,amhc表达细胞的范围缩小.结论 通过外源性DEAB处理能有效地建立视黄酸缺乏的斑马鱼模型,DEAB影响胚胎发育存在剂量依赖性.视黄酸在斑马鱼心脏前后轴发育过程中起重要调控作用,心脏发育早期视黄酸缺乏会抑制心房的发育而支持心室的发育,出现房室分化异常.     

hand2 基因对斑马鱼胚胎发育影响的实验研究

  目的 观察hand2在斑马鱼胚胎内的表达情况，验证显微注射吗啡啉修饰的反义寡核苷酸（Morpholino oligonucleotides，MO）使hand2 表达下调的有效性。观察hand2 表达下调后斑马鱼胚胎发育的异常表型，初步探讨hand2在斑马鱼胚胎发育中的作用，为利用斑马鱼开展hand2的功能研究提供线索。 方法 采用胚胎整体原位杂交的方法观察hand2在斑马鱼胚胎内的表达情况。利用向斑马鱼受精卵显微注射MO的方法使hand2 表达下调，并进行hand2 表达下调的效率验证。将斑马鱼单细胞受精卵分为四组进行显微注射，即对照MO（Con MO）注射组、hand2 MO注射组、hand2-GFP mRNA注射组和hand2-GFP mRNA+hand2 MO注射组。在荧光显微镜下观察hand2-GFP mRNA注射组和hand2-GFP mRNA+hand2 MO注射组的荧光表达情况以验证hand2 表达下调的效率。在显微镜下观察hand2 MO注射组斑马鱼胚胎的各器官发育情况并进行评定。 结果 hand2在斑马鱼胚胎的侧板中胚层、咽弓、心脏和鳍有较强表达。hand2-GFP mRNA注射组在8hpf（hours post fertilization）时胚胎有较强的荧光表达，而hand2-GFP mRNA+hand2 MO注射组胚胎几乎无荧光表达。与Con MO注射组相比，hand2 MO注射组斑马鱼胚胎的心脏、血管、血细胞、鳍以及体节有明显的发育异常。 结论 向斑马鱼受精卵显微注射hand2 MO的方法可有效的使 hand2表达下调。hand2 在斑马鱼胚胎的心脏、血管、血细胞、鳍以及体节的发育过程中有重要作用。     

VEGF反义核酸抑制人胰腺癌细胞的增殖

目的：探讨VEGF121反义核酸对体外培养胰腺癌细胞增殖的影响,以求证明VEGF反义核酸具有抑制肿瘤生长的作用。方法：将稳定转染有VEGF反义核酸pcDNA3-ASVEGF121的胰腺癌细胞系BxPC-3在体外条件下培养,采用ELISA法检测其培养上清液中的VEGF表达水平。检测肿瘤细胞生长曲线,通过克隆形成试验检测肿瘤细胞的体外增值能力。采用Annexin Ⅴ-FITC和PI双标记法以流式细胞仪检测肿瘤细胞凋亡情况。结果：VEGF反义核酸转染BxPC-3细胞后,肿瘤细胞培养液上清VEGF蛋白水平受到明显抑制。生长曲线显示肿瘤细胞生长明显受到抑制,并且肿瘤细胞克隆形成率降低。流式细胞仪检测显示VEGF反义核酸能促进细胞凋亡。结论：人反义VEGF121能显著抑制胰腺癌细胞的VEGF表达,并能抑制肿瘤细胞的生长,促进凋亡。     

VEGF_(121)反义核酸抑制裸鼠胰腺癌移植瘤的增殖及血管生成

目的:探讨VEGF121反义核酸对裸鼠胰腺癌移植瘤的增殖及血管生成的影响,探索通过VEGF反义核酸抑制肿瘤生长.方法:将稳定转染有VEGF反义核酸pcDNA3-ASVEGF121的胰腺癌细胞系Bx-PC-3接种于裸鼠背部皮下.将实验鼠分为实验组、对照组和空白组.定期测定裸鼠移植瘤体积,免疫组织化学法检测裸鼠移植瘤VEGF、Flk-1表达水平.测定裸鼠移植瘤微血管密度.结果:VEGF反义核酸转染BxPC-3细胞后,裸鼠胰腺癌移植瘤生长明显减缓.移植瘤VEGF表达明显受到抑制,Flk-1表达水平上调.裸鼠胰腺癌移植瘤微血管密度明显降低.结论:人反义核酸VEGF121能显著抑制裸鼠胰腺癌移植瘤的增殖,并能抑制裸鼠胰腺癌移植瘤的血管生成.     

斑马鱼胚胎发育过程中Mef2c的表达

目的探讨Mef2c在斑马鱼胚胎骨骼肌和心肌中表达的时相变化.方法收集不同发育时期的AB野生型斑马鱼胚胎,采用整体原位杂交技术检测Mef2c在骨骼肌和心肌的转录情况.结果Mef2c在体节中的表达约在13 hpf,而在心脏中的表达出现在13 hpf以后,与体节中的表达时间基本平行.另外,Mef2c在体节和心脏中的表达一直维持到48 hpf.结论明确了Mef2c在斑马鱼胚胎骨骼肌和心肌发育的表达时相变化,为研究斑马鱼早期骨骼肌和心肌发育的调控机制提供了一定的理论基础.