免疫磁珠法分离胆囊癌CD133阳性细胞及其生物学特性鉴定

目的 建立胆囊癌CD133+细胞分离纯化的方法,观察胆囊癌CD133+细胞和CD133-细胞生物学特性的差异.方法 流式细胞仪检测胆囊癌GBC-SD、SGC996细胞中CD133所占百分比,免疫磁珠法分选CD133+细胞亚群,免疫荧光法定位检测CD133蛋白表达,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测CD133 mRNA表达,细胞计数试剂盒(CCK-8)法检测CD133+组和CD133-组细胞增殖能力及对5-氟尿嘧啶(5-Fu)耐药特性的差异,单克隆形成实验观察单个CD133+细胞生长特性.结果 胆囊癌GBC-SD、SGC996细胞中CD133+亚群所占相对百分比为(68.5±2.9)％、(0.3±0.2)％.GBC-SD组CD133 mRNA相对灰度值(0.6466±0.0259)显著高于SGC996组(0.2181±0.0108,P＜0.01).CD133蛋白定位于细胞膜表面,并在GBC-SD细胞中呈强表达.人胆囊癌GBC-SD细胞分选后,CD133+组CD133蛋白表达明显强于CD133-组.CD133+组中CD133+亚群所占比例为(90.4±0.9)％.CD133+组CD133mRNA相对灰度值(0.7734±0.0217)显著高于CD133-组(0.2146 ±0.0174,P＜0.01).CD133+组细胞增殖能力明显强于CD133-组(P＜0.01).经5-Fu(0.1μg/ml)处理后,CD133+组细胞生存率明显高于CD133-组(P＜0.05).单克隆形成实验结果示单个CD133+细胞可形成新的细胞克隆,且CD133+组[(36.25±2.99)％]细胞克隆球形成率高于CD133-组[(4.50±1.29)％,P＜0.01].体内成瘤实验结果示CD133+组与未分选组移植成瘤率分别为100％和60％,而CD133-组不成瘤.结论 免疫磁珠分选系统可成功分离高纯度的胆囊癌CD133+细胞,而且人胆囊癌CD133+细胞具有一定的增殖、耐药、自我更新及致瘤潜能.     

胃癌组织中CD133的表达及其临床意义

目的研究胃癌组织中CD133表达的相互关系,重点明确术前、术后外周血单核细胞中CD133mRNA表达的临床意义及其与胃癌原发灶CD133表达的关系。方法 50例胃癌、10例胃溃疡穿孔及10名健康自愿者入组研究。胃癌患者术前和术后1周抽外周静脉血各4 ml,密度梯度离心法分离单核细胞,半定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测CD133 mRNA表达水平。胃溃疡穿孔患者术前抽外周静脉血、健康自愿者抽晨血各4 ml。胃癌原发灶及癌旁正常胃黏膜组织分别行RT-PCR、免疫组织化学染色检测CD133 mRNA和蛋白的表达。分析CD133表达对各临床病理特征和预后的影响。结果健康自愿者及术前胃溃疡患者及胃癌患者外周血中CD133 mRNA的半定量值分别为0.029±0.060、0.059±0.099及0.270±0.163(P=0.000)。胃癌患者术前外周血CD133 mRNA表达与肿瘤组织分化程度、淋巴管浸润、肿瘤浸润深度、淋巴结转移及TNM分期均有关(P<0.05)。相关分析显示,胃癌患者术前外周血中CD133 mRNA半定量值与淋巴结转移率(rs=0.422,P=0.002)、癌转移淋巴结枚数(rs=0.398,P=0.004)呈正相关,并与胃癌原发灶中CD133 mRNA的表达呈正相关(rs=0.337,P=0.017)。胃癌原发灶中CD133蛋白表达阳性者,术前外周血中CD133 mRNA的半定量值较CD133蛋白表达阴性者高(Z=-2.539,P=0.011)。50例胃癌患者行胃癌根治术后1周,其外周血中CD133 mRNA半定量值明显高于术前CD133 mRNA的表达水平(P=0.021)。胃癌浸润深度较深者,术后CD133 mRNA表达升高更明显(Z=-1.978,P=0.039)。术后外周血中CD133 mRNA高表达者较低表达者预后更差(χ2=6.193,P=0.013)。结论胃癌患者术前外周血高表达CD133 mRNA,其与肿瘤分化程度、淋巴管浸润、肿瘤浸润深度、淋巴结转移、TNM分期及胃癌原发病灶CD133蛋白表达有关,且与淋巴结转移率、癌转移淋巴结枚数及胃癌原发灶中CD133 mRNA的表达呈正相关。术后患者外周血中CD133 mRNA半定量值较术前明显升高,这一升高提示肿瘤浸润程度较深,患者预后较差。     

胃癌中CXCR4和CD133的表达及其对淋巴转移的影响

目的:探讨CXCR4和CD133在胃癌原发灶中的表达及其对淋巴转移的影响。方法:对50例原发性胃癌原发灶和癌旁胃黏膜组织行免疫组化染色法定位检测CXCR4和CD133蛋白;选用半定量RT-PCR及Western blot法测定CXCR4和CD133 mRNA与蛋白表达量,分析两者的相关性及其与淋巴管浸润和淋巴结转移的关系。结果:CXCR4和CD133分子均定位于肿瘤细胞膜表面,极少数CXCR4位于细胞核内。胃癌组织中CXCR4和CD133表达阳性率及mRNA和蛋白的表达量均明显高于癌旁胃黏膜组织(均P<0.05);CXCR4和CD133 mRNA相对灰度值在淋巴结转移组高于无淋巴结转移组(P=0.011,P=0.038);N1组CXCR4蛋白相对灰度值明显高于N0组(P=0.023),而低于N2+N3组(P=0.008),N1组和N2+N3组CD133蛋白灰度值明显高于N0组(P=0.04,P=0.01),但N1组与N2+N3组之间无明显差异;淋巴管浸润组中的CXCR4和CD133蛋白相对灰度值均高于淋巴管无浸润组(P<0.05);在淋巴转移患者中,CXCR4和CD133蛋白相对灰度值分别与转移淋巴结数(r=0.480,r=0.426)及转移性淋巴结比率(r=0.502,r=0.489)呈正相关。结论:CXCR4和CD133在胃癌原发灶中高表达,两者呈正相关,其联合表达与转移淋巴结比率和转移淋巴结数呈正相关,推测胃癌CD133阳性细胞亚群可能在CXCR4介导下更易导致淋巴管浸润和淋巴结转移。     

腹腔镜胆囊切开取石术中圈套器套扎胆囊壁切口法与丝线缝合胆囊壁切口法的临床疗效对比

目的 比较腹腔镜胆囊切开取石术中圈套器套扎胆囊壁切口法与丝线缝合胆囊壁切口法的临床疗效。方法 回顾性分析同济大学附属东方医院胆石中心2020年1月－2022年1月收治的206例胆石病患者的临床资料,按照手术方式分为圈套组（n = 86）和缝合组（n = 120）,对比两组患者手术情况、手术并发症情况和术后胆囊恢复情况。结果 所有患者顺利完成手术,圈套组手术时间较缝合组短［（19.98±2.31）和（34.97±2.21）min］,差异有统计学意义（P < 0.01）。圈套组术中出血量较缝合组少［（5.29±1.00）和（16.98±2.17）mL］,差异有统计学意义（P < 0.01）;两组患者住院时间［（2.28±0.75）和（3.46±0.66）d］比较,差异有统计学意义（P < 0.01）。两组患者手术并发症比较,差异无统计学意义（P > 0.05）,圈套组术后无胆囊内血凝块形成和胆囊急性炎症发生。两组患者术后胆囊结石复发率比较,差异无统计学意义（P > 0.05）。圈套组术前与术后的胆囊排空率和胆囊壁厚度比较,差异无统计学意义（P > 0.05）。结论 圈套器套扎胆囊壁切口法安全可行,可明显缩短手术时间和住院时间,减少术中出血量,避免胆囊切开取石术后胆囊内血凝块形成及急性炎症的发生,值得临床推广。     

胃癌原发灶中Snail和CXCR4的表达及其与临床病理特征和预后的关系

目的研究趋化因子受体4（CXCR4）与上皮间质转化（EMT）相关因子Snail表达与胃癌临床病理特征、预后的关系。方法利用免疫组化方法检测50例胃癌组织中CXCR4和Snail的表达,分析Snail和CXCR4表达与胃癌患者的临床病理学指标的关系,Spearman等级相关方法分析Snail和CXCR4表达的关系,Kaplan—Meier方法分析CXCR4和Snail表达与胃癌患者生存的关系。结果Snail和CXCR4表达阳性率各为62％（31／50）和58％（29／50）;肿瘤越大、组织分化越差、有血管浸润、淋巴管浸润、存在淋巴结转移和浸润越深Snail阳性表达越高。肿瘤越大、有血管浸润、有淋巴管浸润、存在淋巴结转移和浸润越深,则CXCR4阳性表达越高。Spearman相关分析表明,Snail与CX—CR4的表达呈正相关（r=0．330,P=0．014）。Snail和CXCR4共同阳性表达为患者术后生存的独立预后因素（P=0．001）。结论CXCR4和Snail共同表达为胃癌患者独立预后因子,两者之间可能互相联系促进胃癌的侵袭和转移,通过靶向CXCR4和EMT相关因子或能干预胃癌的转移与复发。     

RNA干扰抑制KATO-Ⅲ CD133阳性胃癌细胞CD133基因表达及对其生物学特性的影响

目的 探讨CD133基因表达被抑制后对胃癌细胞增殖、侵袭、克隆球形成及化疗药物敏感性的影响.方法 通过免疫磁珠分选KATO-Ⅲ胃癌细胞中的CD133阳性细胞,将合成的CD133小干扰核糖核酸分子（siRNA）转染至KATO-ⅢCD133阳性胃癌细胞内,使用荧光标记的siRNA （FAM-siRNA）检测转染效率,通过RT-PCR、Western-blot方法检测CD133基因表达的沉默效果及上皮-间质转化（EMT）相关因子（E-cadherin、Snail和N-cadherin）的蛋白表达,采用CCK-8、Transwell侵袭实验、单克隆球形成实验和CCK- 8等方法分别检测细胞增殖、侵袭、克隆球形成能力及对化疗药物5-氟尿嘧啶（5-FU）的敏感性.结果 转染24 h后,转染效率可达到（87.7±8.1）％.干扰组CD133 mRNA及蛋白的表达显著低于阴性对照组（P＜0.01）.转染24、48和72 h后,与阴性对照组比较,干扰组细胞的增殖活性均得到显著抑制,差异均有统计学意义（P＜0.01）;转染72 h,干扰组细胞的增殖活性较阴性对照组降低了（52.1±8.0）％.与阴性对照组比较,干扰组的细胞侵袭数减少[（41.7±6.0）比 （130.3±11.0）,P＜0.05],克隆球形成率降低[（24.3±4.3）％比（45.1±6.4）％,P＜0.01],Snail和N- cadherin蛋白表达降低（P＜0.01）,而E-cadherin蛋白表达增高（P＜0.01）.干扰组细胞对化疗药物5-FU的敏感性显著增强,5-FU对干扰组细胞的抑制率为（62.4±3.3）％,较阴性对照组的（21.5±2.2）％增加（P＜0.01）.结论 CD133基因在胃癌细胞的增殖、侵袭、克隆球形成和化疗抵抗性等方面具有重要作用,可能是胃癌干细胞新型标志物,有望成为胃癌生物治疗的新靶点.     

CD133通过上皮间质转化促进胃癌侵袭和转移的研究

目的观察胃癌细胞CDl33表达与胃癌侵袭的关系,进而探讨其是否通过上皮间质转化（EMT）促进胃癌侵袭和转移。方法通过免疫磁珠分选技术,将KATO-Ⅲ细胞分为CDl33阳性细胞和CDl33阴性细胞,利用Transwell小室法检测其侵袭能力,并通过Western blot和RT-PCR方法检测siRNA干扰CDl33基因沉默前后其EMT相关因子的表达差异。Western blot法检测50例胃癌组织及癌旁组织CDl33和EMT相关因子的表达．并分析其相关性。结果CDl33阳性组穿膜细胞数（67．7±10．5）显著高于CDl33阴性组（13．3±6．8,P=0．001）。CDl33阳性细胞中Snail和N-cadherinmRNA及蛋白表达显著高于CDl33阴性细胞．而E-cadherin表达则明显低于CDl33阴性细胞（均P〈0．05）。siRNA干扰后,Snail和N-cadherinmRNA及蛋白表达明显下调,而E-cadherin表达则显著上升（均P〈0．05）。胃癌组织中CDl33、Snail及N-cadherin蛋白相对表达为0．635±0．119、0．599±0．114及0．754±0．154,明显高于癌旁组织的0．485±0．116（P=0．029）、0．259±0．108（P=0．020）和0．329±0．134（P=0．001）,而E-cadherin蛋白表达相对表达为0．378±0．123,明显低于癌旁组织的0．752±0．156（P=O．003）。相关分析显示,Snail及N-cadherin的表达与CDl33表达呈正相关（P〈0．05）,而E-cadherin的表达则与CDl33表达呈负相关（P〈O．05）。结论CDl33阳性胃癌细胞具有更强的侵袭能力,并可能通过EMT促进胃癌的侵袭和转移。     

化疗药物对胃癌CD133+细胞亚群的作用及其对相关凋亡基因表达的影响

目的 研究常规化疗药物对纯化的胃癌CD133+细胞亚群的作用及对相关凋亡基因Bcl-2和BAX的mRNA表达的影响,进而探讨胃癌耐药的作用机制.方法 采用免疫磁珠分选术分离纯化KATO-Ⅲ细胞株中CD133+和CD133细胞亚群.采用CCK-8法分析两种亚群细胞对不同化疗药物5-氟尿嘧啶(5-FU)、顺铂及依托泊苷(VP-16)敏感性的差别.行半定量聚合酶链反应分析化疗药物诱导后相关凋亡基因表达产物的表达差异.结果 KATO-Ⅲ细胞磁珠分选纯化后,经流式细胞仪分析结果显示:分选后CDI33+组所得细胞CD133+表达率为90％.5-FU、顺铂及VP-16分别作用12h后,CD133+组及CD133-组均开始出现凋亡的形态学改变.CCK-8检测发现CD133+组细胞生长抑制比率较CD133-组有一定程度的下降[5-FU组为:(30.56±1.99)％ ～ (88.60±1.95)％ vs(32.81±2.67)％ ～ (35.55±3.23)％,P =0.045;顺铂组为:(45.89±3.64)％ ～ (81.20±1.18)％ vs(50.21 ±3.22)％ ～(90.46±1.89)％,P=0.043; VP-16组为:(37.21±3.80)％ ～ (78.49±3.22)％ vs (35.55±3.23)％ ～ (89.32±3.54)％,P=0.048].3种化疗药物干预后,两组亚群细胞中均呈现凋亡抑制因子Bcl-2 mRNA表达降低,凋亡因子BAXmRNA表达升高.这些变化在CD133+组中较CD133组中更为明显.结论 胃癌CD133+细胞亚群对5-FU、顺铂及VP-16具有一定耐药潜能.可能是由于BAX基因上调及Bcl-2基因下调进而诱导胃癌CD133+细胞亚群凋亡,并由此而获得对肿瘤药物的抵抗性.     

胃癌KATO-Ⅲ细胞CD133基因的siRNA干扰及其效果比较

目的 比较3段化学合成的siRNA对KATO-Ⅲ胃癌细胞中CD133基因的抑制效果,并初步探讨CD133基因表达被抑制后对胃癌细胞增生的影响.方法 实验分为空白对照组、阴性对照组、CD133siRNA-1组,CD133siRNA-2组和CD133siRNA-3组.针对CD133mRNA序列设计并合成3段siRNA,利用荧光标记的siRNA转染KATO-Ⅲ胃癌细胞后,通过共聚焦显微镜荧光计数检测其转染率,用RT-PCR法和Western blot法检测并比较3段siRNA对CD133基因表达的沉默效果,采用CCK-8法检测CD133表达被抑制后对胃癌细胞增生的影响.结果 siRNA在KATO-Ⅲ细胞中的转染效率可达到(85±8)％,所设计的3段siRNA均可显著抑制胃癌KATO-Ⅲ细胞CD133基因的表达,抑制率分别为(11±2)％、(19±2)％和(24±3)％.与空白组比较,CD133siRNA-3转染组细胞的增生活性降低了(42±4)％(P＜0.05).结论 成功转染并抑制了KATO-Ⅲ胃癌细胞中CD133基因的表达,并从中筛选出了干扰效果最佳的CD133siRNA片段,为后续CD133+胃癌细胞的干扰提供初步的实验研究.     

CXCR4和CD133mRNA在胃腺癌原发灶中的表达及其临床意义

目的 探讨CXCR4和CD133mRNA在胃腺癌原发灶中的表达及其与各临床病理参数之间的关系.分析CXCR4和CD133mRNA二者间的相关关系.方法 分析50例胃腺癌原发灶和癌旁胃黏膜组织行免疫组化法定位检测CXCR4和CD133 mRNA的相对表达率,并用半定量RT- PCR法测定CXCR4和CD133mRNA的相对灰度值,分析上述两者间的相互关系(Fisher精确概率法).分析CXCR4和CD133mRNA与临床病理因素之间的联系(Spearman相关分析).结果 CXCR4和CD133mRNA在胃腺原发灶中的阳性表达率分别为76.0％和66.0％,显著高于癌旁胃黏膜组织中的16.0％ (P =0.000)和10.0％ (P =0.000).肿瘤直径越大、TNM分期越晚及淋巴管浸润存在,则CXCR4mRNA 灰度值就越高(P＜0.05).肿瘤较大,TNM分期较晚者,CD133mRNA灰度值越高(P＜0.05).CXCR4 和CD133mRNA相对灰度值变化呈正相关(r=0.453,P＜0.01).结论 CXCR4和CD133mRNA的高表达与胃癌的肿瘤直径、TNM分期及淋巴管浸润有关.CD133mRNA相对灰度值随CXCR4mRNA相对灰度值增加而增加.