骨髓间充质干细胞诱导分化的成骨细胞转染增强型绿色荧光蛋白基因后复合生物衍生骨的研究

目的:探讨绿色荧光蛋白(GFP)基因转染本身是否可以改变细胞复合材料的生物学特性,从而影响材料生物相容性的正确评价?方法:将增强型绿色荧光蛋白(EGFP)转基因技术成功标记人源骨髓间充质干细胞(MSCs)诱导分化的成骨样细胞,再与人源生物衍生骨复合培养;同时设立未转染EGFP基因的骨髓MSCs诱导分化的成骨样细胞直接与人源生物衍生骨复合培养作为对照,通过倒置显微镜?荧光显微镜?扫描电镜对比观察?结果:发现转染EGFP基因的MSCs诱导分化的成骨样细胞能够成功地复合于人源生物衍生骨上,且生长状态较好?与未转染组细胞复合材料的情况相比,转染组与其没有明显差异?结论:EGFP基因转染技术没有对MSCs诱导分化的成骨样细胞复合衍生骨的能力以及增殖生长活性造成明显损害,从而不会影响对于材料生物相容性的正确评价?     

人骨髓基质干细胞体外诱导成脂过程形态学变化的观察

目的 了解骨髓基质干细胞(MSC)诱导成脂分化过程的形态变化．为诱导分化阶段的识别提供部分实验依据。方法 由健康成年女性骨髓组织分离而得的MSC体外培养、扩增后，使用成脂诱导复合培养液诱导6～30d，每日在Olympus相差显微镜下观察细胞形态变化或油红-O染色。结果 MSC在诱导分化前呈长梭形，随着分化的进程，逐渐趋于椭圆、类圆，直至圆形．胞体也逐渐变大。细胞在分化过程中特征性的形态学变化是细胞内脂滴的变化(相当于不成熟脂肪细胞和成熟脂肪细胞阶段)．从无到有，从胞膜下脂肪小颗粒到脂滴、脂泡，经历脂滴的增多和融合过程．直至整个细胞充满大脂泡，细胞分化进入终末阶段。结论 MSC成脂诱导的过程中，分化进入不成熟及成熟脂肪细胞阶段因有特征性的脂滴变化而易识别．但从MSC分化到前脂肪细胞阶段并无明显的形态学特征，可能需通过特异性表达产物来鉴定。     

体外培养前脂肪细胞与生物衍生材料小肠黏膜下层复合的黏附状态

背景:细胞与支架的成功复合是组织工程重要的技术环节,小肠黏膜下层作为一种生物衍生材料具有良好的细胞相容性,同时促血管化能力较强.目的:观察前脂肪细胞与小肠黏膜下层的体外复合情况及其黏附状态.设计、时间及地点:2004-07/2005-07在四川I大学华西医院组织工程实验室完成的随机对照细胞观察.材料:前脂肪细胞来源于腰椎创伤前路手术的成年女性腹部皮下脂肪组织.小肠黏膜下层来源于新鲜猪大肠,为白色半透明膜,由四川大学华西医院组织工程实验室制各.方法:将脂肪组织剪碎成颗粒状,采用酶消化法获得原代前脂肪细胞,传代后加入含有地塞米松、胰岛素、IBMX、吲哚美辛的诱导培养基进行扩增.将小肠黏膜下层预湿,分3种方式,即分别用磷酸盐缓冲液、10%胎牛血清、10%胎牛血清 DMEM浸泡.取第3代前脂肪细胞制备细胞悬液,分两种方法接种在小肠黏膜下层:浸渍法是直接向置有小肠黏膜下层的孔内加入1 mL细胞悬液;沉淀法是向每个小肠黏膜下层的表面均匀滴入按所需接种密度高浓缩的细胞悬液20 μL.主要观察指标:MTT法检测小肠黏膜下层经不同预湿和接种方法对黏附细胞数的影响.苏木精-伊红染色和电镜观察前脂肪细胞在小肠黏膜下层的黏附状态.结果;相同接种方法下,经3种方式预湿的小肠黏膜下层细胞吸光度值基本相似(P＞0.05).相同预湿方式下,沉淀法接种细胞黏附率显著高于浸渍法(P＜0.05).采用沉淀法接种复合,按种密度为(2.5～7.5)×104 /cm2时黏附细胞数逐渐增多,呈正性相关(r=0.93,P＜0.05),升高至1×105 /cm2后黏附细胞数不再增加.接种24 h后,前脂肪细胞能够在小肠黏膜下层表面生长,并有突起长出.结论:①小肠黏膜下层给予不同的预湿方式对前脂肪细胞黏附状态无影响,但沉淀法接种复合效果优于浸渍法.②1×105 /cm2为前脂肪细胞最佳接种密度,其在小肠黏膜下层上具有良好的黏附性.     

低温保存的组织工程化骨修复骨缺损的形态学研究

目的：目前的研究主要集中在组织工程化骨的构建方面，而组织工程化骨要在外科手术中随时应用，必然涉及长期保存，为此探讨低温保存的组织工程化骨修复骨缺损的能力以及低温保存组织工程化骨的可行性。方法：将人源性生物衍生骨材料复合成骨细胞构建的组织工程化骨，在4℃和—196℃的温度环境中保存3个月和6个月，同时以未行低温保存的组织工程化骨和生物衍生骨材料作为对照，分别修复实验兔桡骨的长段骨缺损，于术后2，4，6，12周时各处死4只动物取材，行大体和组织学观察。结果：4℃和—196℃的温度保存组和未行保存的组织工程化骨组在动物体内相同时间点大体与组织学观察无明显区别，低温保存3个月与6个月组在动物体内相同时间点大体与组织学观察无明显区别；组织工程化骨各组与单纯生物衍生骨材料组比较，前者在骨缺损处产生更多的胶原与新骨，其修复骨缺损是通过多点方式成骨，成骨迅速，骨愈合更快：而单纯生物衍生骨材料组则从两端“爬行替代”方式成骨；所有各组无明显排斥反应。结论：采用低温(4℃和—196℃)保存方法均能有效保存组织工程化骨，从形态学研究证实该保存方法有效可行。     

兔胎盘来源间充质干细胞修复兔桡骨骨缺损的实验研究

目的 探讨兔胎盘来源间充质干细胞(PMSCs)构建的组织工程化骨修复兔桡骨节段性骨缺损的能力.方法 取24只大耳白兔,于兔双侧桡骨中下段制造1.5cm的节段性骨缺损,左侧骨缺损用PMSCs构建的组织工程化骨桥接(实验组),右侧用骨髓基质干细胞(BMSCs)构建的组织工程化骨桥接(对照组).实验动物双侧于术后2、4、8、...     

缺氧对hBMSCs和胎盘来源MSCs增殖的影响

目的 比较hBMSCs和人胎盘基蜕膜MSCs(human placental dccidua basalis-MSCs,hPDB-MSCs)在化学缺氧条件下的增殖情况,为寻找组织工程新的种子细胞提供理论依据. 方法 采用密度梯度离心法分离培养hBMSCs与hPDB-MSCs,流式细胞仪检测细胞表面标志物;COCl2建立化学缺氧模型,MTT法检测两种细胞在不同CoCl2浓度(0、50、75、100、125、150、175、200μmol/L)和不同时间(6、12、24、48、72和96 h)的增殖情况. 结果 流式细胞仪检测显示hPDB-MSCs与hBMSCs均表达CD9、CD29、CD44、CD105、CD106、人类白细胞抗原ABC(human leucocyte antigen ABC,HLA-ABC),不表达CD34、CD40L和HLA-DR;但与hBMSCs相比,hPDB-MSCs阶段特异表达的胚胎抗原1(stage-specific embryonic antigen 1,SSEA-1)、SSEA-3、SSEA-4、肿瘤排斥抗原(tumor rejection autigen, TRA)-1-60、TRA-1-81表达更高.化学缺氧12 h内,hBMSCs与hPDB-MSCs增殖均被抑制,12 h后均能促进增殖;与对照组比较,hBMSCs经150 μmol/L CoCl2作用24 h出现显著增殖(P<0.05),hPDB-MSCs在75μmol/LCOCl2作用12 h后出现显著增殖(P<0.05). 结论 与hBMSCs相比,hPDB-MSCs表达更高的胚胎干细胞特有表面抗原,同时对化学缺氧所致的增殖影响更为敏感,可能成为一种新的组织工程种子细胞来源.     

膀胱平滑肌细胞与小肠黏膜下层体外复合培养的实验研究

目的探讨体外快速培养犬膀胱平滑肌细胞的方法及观察膀胱平滑肌细胞在脱细胞小肠黏膜下层(small intestinal submucosa,SIS上的生长状况,为构建组织工程膀胱平滑肌组织提供实验依据。方法分别采用酶消化法和组织块培养法分离、获取和原代培养犬膀胱平滑肌细胞,倒置相差显微镜下观察细胞的生长情况,透射电镜观察细胞的超微结构,免疫组织化学染色进行细胞鉴定。将犬膀胱平滑肌细胞接种到SIS支架材料上,于复合培养5、7及9d取材,行苏木素染色、石蜡切片HE染色和扫描电镜观察膀胱平滑肌细胞在SIS上的生长状况。以细胞-SIS复合培养组为实验组,以膀胱平滑肌细胞为对照组,每组各设9孔,分别于接种后3、5及7d取材,酶消化后收集细胞并计数。结果酶消化法原代培养获取犬膀胱平滑肌细胞数量多,细胞生长速度快,形态良好,培养5d细胞在培养瓶底生长汇合。组织块培养法接种3d见长梭形的膀胱平滑肌细胞从植块边缘萌出,获取的细胞数量较少。透射电镜下见膀胱平滑肌细胞胞质中有特征性细肌丝和细胞膜的密斑。抗α-肌动蛋白免疫组织化学染色胞浆呈棕黄色阳性反应。膀胱平滑肌细胞在SIS表面能黏附、生长和增殖。体外复合培养5d后,膀胱平滑肌细胞铺满SIS表面,呈单层细胞结构。7、9d细胞形态与5d相似。实验组3、5及7d的细胞计数分别为(16.85±0.79)×105、(39.74±2.16)×105及(37.15±2.02)×105个,对照组分别为(19.43±0.54)×105、(34.50±1.85)×105及(33.07±1.31)×105个。两组5d细胞计数差异有统计学意义(P<0.05)。结论酶消化法原代培养膀胱平滑肌细胞可提供大量活性良好的种子细胞。SIS支持膀胱平滑肌细胞黏附和生长,可为构建组织工程膀胱平滑肌组织提供良好支架。     

改良的硬组织包埋技术对乳牙破骨细胞的观察

硬组织切片技术主要应用于骨组织、羟基磷灰石等坚硬标本的切片制作。牙齿比以上标本更坚硬。传统的牙齿标本是将一颗牙齿磨成一张薄片来观察其结构 ,且不能进行一般组织样本的染色观察。为了解儿童乳牙髓腔内破骨细胞的数量 ,进而为收集破骨细胞进行培养提供依据 ,我们采用硬组织两次包埋技术 ,使切片可进行组织学、免疫组织化学染色 ,获得较理想的破骨细胞观察结果 ,报告如下。1　材料与方法　　莱卡 16 0 0切割机 ,莱卡 2 5 0 0 E切片机 ,口腔慢速涡轮机 ;乙二醇乙醚乙酸酯 ,甲基丙烯酸甲酯 ,过氧化苯甲酰 ,离体乳牙。第 1渗透液 :甲基…     

左旋精氨酸对大鼠成骨细胞的影响

一氧化氮（NO）是一种可高度弥散的自由基。作为第2信使和神经递质，是细胞-细胞间信息传递的重要调节因子。NO可以调节成骨细胞（osteoblast，OB）的增殖及其功能活性，从而在维持骨形态和骨重建中起着重要作用。我们在以往实验基础上，观察不同浓度的NO外源性供体左旋精氨酸（L—arginine）对大鼠OB增殖，护骨素（OPG）分泌及cNOS和iNOS表达的影响。[第一段]