鱼类胚胎干细胞研究进展

胚胎干细胞(Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃｓｔｅｍｃｅｌｌ,ＥＳ细胞)是从动物早期发育胚胎内细胞团或原始生殖细胞分离得到的一种未分化的永久性细胞系,它一方面保留了所有的发育潜力,在适合的条件下,能够分化成多种类型的细胞、组织。将ＥＳ细胞移植到动物囊胚后,它可以参与宿主胚胎各种组织的构成,形成嵌合体,直至达到种系嵌合,遗传给后代;另一方面,人们可以对ＥＳ细胞的基因组进行各种遗传操作,包括随机引入外源基因到ＥＳ细胞基因组中,或通过同源重组,定点引入外源基因到ＥＳ细胞基因组中或破坏基因组中某一特定的靶基因;通过细胞移植或核移植技…     

半滑舌鳎抗缪勒氏管激素(AMH)基因的克隆及组织表达分析

本研究克隆了半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)AMH基因并对其进行表达分析。该基因cDNA序列开放阅读框长为1 563 bp,编码蛋白含520个氨基酸。该蛋白含有TGF-β超家族的特征序列,包含1个AMH-N区域和TGF-β结构域,并在C端生物活性区含有9个保守的半胱氨酸残基。系统进化分析表明,半滑舌鳎AMH和所有鱼类AMH聚为一簇,与鲽形目相似性最高。实时定量结果表明,AMH基因在半滑舌鳎不同组织中有差异表达,在正常雄鱼和伪雄鱼性腺中表达量最高。胚后不同时期性腺的实时定量结果表明,性腺分化之前AMH在精巢中相对表达量较低,70 dph(days post hatching)达到最高峰,而在卵巢中呈现先升高后下降的趋势,预示AMH基因可能在半滑舌鳎性腺发育中起重要作用。较正常雄鱼后代而言,AMH基因在伪雄鱼后代的雄鱼和伪雄鱼性腺中的表达都有升高的趋势,而在雌鱼中无明显差异,也预示其可能参与半滑舌鳎的性反转过程。     

半滑舌鳎Dmrt1蛋白表达、纯化及功能

通过分析半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis) Dmrt1重组蛋白注射卵巢后基因表达调控, 探讨Dmrt1在半滑舌鳎性别决定与分化中的功能。实验利用原核表达系统(Pet-32a)对半滑舌鳎Dmrt1基因进行重组表达, 并通过亲和层析纯化获得了重组目的蛋白(Pet-32-dmrt1)。重组蛋白注射卵巢后实时定量PCR分析结果显示, Cyp19a和Foxl2在6～24 h内两基因表达量均显著下调, Sox9a基因表达量在6～24 h内有显著上调, 但48 h后3个基因的表达量逐渐恢复正常表达水平。研究结果证实, Dmrt1重组蛋白具有生物活性, 且对性别相关基因表达调控具有一定的影响, 在性别决定中发挥一定作用。

     

抗迟缓爱德华氏菌病牙鲆家系的筛选与分析

牙鲆(Paralichthys olivaceus)养殖病害日益严重,迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)是牙鲆养殖中的主要致病菌,带来了极大的经济损失,为了培育出对该病抵抗能力强的牙鲆新品种,2014年4–6月间,利用我们长期以来建立和筛选出来的牙鲆抗病群体和家系的亲鱼,通过杂交,自交,雌核发育建立47个家系,9–10月间,对其中39个家系进行感染实验,先用少量鱼进行预实验摸索出半致死浓度,然后再进行正式感染实验,感染数量为每个家系80尾。各家系的存活率范围为1.19%~51.19%,最终平均存活率为20.29%,认为存活率高于30%的7个家系为抗病力强家系,存活率在20.29%~30%的9个家系为抗病力一般家系,平均存活率以下的23个家系为抗病力弱家系。1406#家系抗病力最强,它为1005#家系的自交后代,而其他抗病力强家系也大多是1005#、09104#、0915#的后代。而09104#为0768#的后代,并且0768#抗鳗弧菌病能力强。1005#为韩国群体自交后代,0915#为韩国群体和日本群体杂交后代。这些抗病力强的牙鲆可以作为新品系进行推广养殖,可望减少牙鲆腹水病发生。     

异源和同源dmrt1基因过表达载体在青鳉体内的整合和表达

利用半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)dmrt1基因和青鳉(Oryzias latipe)dmrt1基因构建过表达载体,采用显微注射技术将两种载体分别导入青鳉受精卵中,比较异源和同源dmrt1基因对青鳉胚胎孵化率的影响以及两种dmrt1基因在青鳉体内的基因整合率、基因表达率及对芳香化酶基因(cyp19a)表达的影响。结果表明,注射48 h后,两种载体均在胚胎内大量表达,注射青鳉同源性dmrt1载体的受精卵孵化率(69.5%)要显著高于注射异源性dmrt1载体的受精卵(36.5%)。30 dph(days post hatching)两组被注射稚鱼均能检测到基因整合,注射同源dmrt1的整合率(30%)要高于异源dmrt1(10%)。30 dph稚鱼体内检测不到异源性dmrt1载体的表达,但能检测到同源dmrt1载体的mRNA表达,同时芳香化酶基因的表达受到了抑制。本研究为研究舌鳎性别分化相关基因功能提供了基础,并为在模式鱼类中研究海水鱼相关基因功能累积了必要的资料。     

温度对半滑舌鳎生长及性类固醇激素水平的影响

为了探索温度对半滑舌鳎幼鱼生长及性别的影响,本研究以半滑舌鳎家系为材料,在受精后32 d,将建立的家系鱼苗分别置于9、21、23、25和27℃水温下进行培育,在32~142 dpf测量各培育温度下半滑舌鳎幼鱼的体长和体质量,利用SPSS软件中方差分析和相关分析法多重比较分析幼鱼生长规律、温度与体长和体质量的相关性。结果表明,在98 dpf时,25℃下幼鱼生长最快,但培养至129~142 dpf时,23℃温度组生长速度显著高于其他温度组。23和25℃下的半滑舌鳎体质量特定生长率分别为4.42%和4.63%,明显高于其他温度处理组。温度与半滑舌鳎家系体长、体质量的Pearson系数分别为0.271和0.260,极显著正相关。体长、体质量与温度的关系式分别为L=1.637 6T0.378 2(R2=0.082),W=0.028 5T1.078 1(R2=0.075)。采集23℃下半滑舌鳎受精卵和3~142 dpf的鱼苗,进行性类固醇激素表达水平分析。结果显示,睾酮(T)和雌二醇(E2)含量在受精卵中最高(54.78 ng/mg和92.52 pg/g),3~32 dpf时逐渐降至最低值(4.6 ng/mg和5.43 pg/g)。至46 dpf时又显著上升到峰值[(40.81±12.64)ng/mg和(42.04±19.13)pg/g],之后显著下降。在温度控制组,32~46 dpf各个温度组鱼苗T和E2含量显著上升,46 dpf时达到峰值,但19和21℃温度组显著高于其他组,T分别为(94.70±45.06)和(85.45±37.30)ng/mg,E2分别为(83.37±17.97)和(105.80±54.90)pg/g;其他温度组T和E2含量相对较低且无显著差异。98 dpf性类固醇激素表达量显著下降,各温度组E2水平无显著差异,但19和27℃时T水平高于其他温度组。依此推测46 dpf、体长(4.99±0.75)cm时半滑舌鳎鱼苗性腺开始分化,19和27℃有可能促使鱼苗雄性化。     

半滑舌鳎 WT1a 基因的克隆与性别分化期的表达分析

从半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)全基因组序列中获得肿瘤抑制基因 WT1a 的部分序列, 然后利用 RACE 技术克隆了WT1a 基因的全长, 运用组织学方法, 对半滑舌鳎性腺分化早期的组织切片进行了观察, 并分析了该阶段WT1a 的表达特征。克隆结果显示, WT1a 基因cDNA全长为1 886 bp, 开放阅读框(ORF)长为1 470 bp, 编码490个氨基酸, 并且包含 KTS 三肽, 5′-UTR 和3′-UTR 分别长为245 bp 和171 bp。在 ORF 末端发现2个微卫星(SSR)序列和2个跨膜螺旋区域, 而在其他物种中未发现这些区域。氨基酸序列分析显示, WT1a 基因的保守性很高, 与人的同源性高达90%。通过组织切片观察发现, 该批半滑舌鳎在56 d时性腺开始分化, 并且卵巢分化早于精巢。荧光实时定量分析结果显示, WT1a 在半滑舌鳎成鱼性腺中表达量显著高于其他各组织, 在肝、肾、脾、心脏等组织中有微量表达, 并且在成鱼性腺中, 雄鱼表达量显著高于雌鱼, 雌鱼显著高于伪雄鱼。在胚胎发育各时期以及初出膜后WT1a的表达结果显示, 在12 h (原肠早期)显著升高, 20 h (神经胚期)达到最高。在性腺分化早期雌雄性腺中的表达结果显示, WT1a 在雌雄半滑舌鳎16~66 d 的性腺中表达量持续平稳升高, 在性腺分化时期表达量并没有特殊的变化。这些研究结果说明, WT1a 基因是半滑舌鳎性别相关基因, 并在半滑舌鳎的性腺分化、发育过程中持续表达, 但可能对性腺的分化过程并不起决定作用。

     

牙鲆亲本间遗传距离与其后代生长速度的相关性分析

分子标记技术为直接从DNA水平上认识生物个体遗传差异提供了强有力的工具,用其分析亲本间遗传距离与后代生长性状之间的关系是水产育种研究的重要方向之一。选用21个多态性微卫星分子标记,以8个日本牙鲆（JS）个体和24个抗病牙鲆（RS）个体为亲本产生的28个杂交组合为材料,分析了该32个牙鲆亲本的遗传多样性,同时对牙鲆亲本间遗传距离与其后代生长速度的相关性进行了研究。结果表明：（1）21个微卫星标记共扩增出123个等位基因,32个牙鲆亲本中的等位基因数(A),有效等位基因数(Ae),观测杂合度(Ho),期望杂合度(He),多态信息含量（PIC）分别在2~15,1.3423~7.8168,0.2333~1.000,0.2593~0.8859,0.2225~0.8613之间变动,相应的平均值分别为5.86,3.7951,0.6931,0.6784,0.6237。（2）进行亲本间遗传距离（GD）与其后代生长速度（AGRw）的相关性分析发现,亲本间最小遗传距离为0.2578,最大遗传距离为0.9773,不同遗传距离范围内,亲本间遗传距离与后代生长速度之间呈现不同的相关性：在0.2578~0.5958范围内,亲本间遗传距离与后代生长速度呈显著的正相关（P<0.05）;在0.6099~0.6604范围内,亲本间遗传距离与后代生长速度之间没有表现出显著的相关性;在0.6640~0.9773范围内,亲本间遗传距离与后代生长速度呈显著的负相关（P<0.05）。     

人工栽培铁皮石斛品质评价

摘要：通过比较不同栽培方式和不同收获时间的铁皮石斛营养指标,评价泰顺县铁皮石斛的品质。结果表明,林下二年生铁皮石斛品质最佳,多糖和甘露糖含量分别达到3079%和3147%,显著高于大棚一年生和大棚二年生。此外,林下二年生铁皮石斛的总灰分和水分含量分别为422%和376%,符合《中华人民共和国药典》2015年版项规定。相比大棚种植铁皮石斛,泰顺县林下栽培铁皮石斛的品质较优。     

半滑舌鳎Shh基因的克隆与表达及甲基化分析

通过RACE方法获得半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)Hh基因家族的Shh基因,该基因全长1 922 bp,其中5′UTR 266 bp,3′UTR 360 bp,ORF1 296 bp,编码431个氨基酸,经预测该多肽的相对分子质量为47.28 k D,理论等电点6.95,具有Hh基因家族特有的保守结构域。氨基酸序列分析表明,半滑舌鳎Shh与牙鲆的同源性最高,为82%,与其他鱼类同源性为74%~81%,与非洲爪蟾的同源性为61%,与人和鼠的同源性为63%~64%。甲基化结果显示,Shh基因在1龄卵巢中的甲基化程度普遍低于雄鱼与伪雄鱼精巢。基因表达分析显示,Shh基因在胚胎期的囊胚期表达显著高于其它时期(P0.05),在雌雄成鱼8个组织器官均表达,在雌性性腺分化的关键期孵化后50 d,雌性性腺中表达量较前期升高,且显著高于同时期雄性性腺中的表达(P0.05),在雄性性腺分化的关键期80~95 d,Shh基因在雄性中的表达水平显著升高(P0.05),在8月龄、1龄及2龄雌鱼性腺中表达显著高于雄鱼与伪雄鱼。本研究表明,半滑舌鳎Shh基因在进化中高度保守,与胚胎分化、组织器官形成、雌雄性腺分化及性腺发育密切相关。