粘红酵母酪氨酸解氨酶在大肠杆菌中的异源表达

酪氨酸解氨酶是苯丙氨酸代谢途径的关键酶之一。酪氨酸经其催化生成对香豆酸,可进一步生成白藜芦醇、柚皮素等具有抗氧化、抗衰老作用的苯丙素类天然产物。作者选取来源于粘红酵母(Rhodotorula glutinis)的酪氨酸解氨酶,对其基因进行大肠杆菌(Escherichia coli)密码子偏好性优化,合成基因后于E.coli BL21(DE3)中成功表达。经过硫酸铵分级沉淀、QFF阴离子交换层析、分子筛纯化后得到了纯化的酪氨酸解氨酶,比酶活达到1.78 U/mg。在相同的培养条件下,以不同的质粒作为表达载体,获得了不同的对香豆酸产量。其中以酪氨酸为底物发酵24 h,当以p ET-32a(+)作为表达载体时,获得最高的对香豆酸产量196.3 mg/L。经密码子优化后的酪氨酸解氨酶基因可更好地应用于苯丙素类物质的合成途径构建,不同载体的应用也为生物法生产对香豆酸提供了更多的选择依据。     

优化黑曲霉柠檬酸生产菌株原生质体形成条件及表达系统的建立

优化了黑曲霉柠檬酸生产菌株的原生质体形成条件并建立基因表达系统。利用酶解法制备原生质体,最优的酶解液配比为5 mg/m L溶壁酶、0.2 U/m L几丁质酶和460 U/m L葡萄糖醛酸酶。最优的渗透压稳定剂为0.7 mol/L KCl,菌丝层厚度50μm,菌体量为0.003 g/m L。在培养基中添加1 mmol/L Mn2+有助于减少原生质体形成所需的酶量,在培养基中添加葡萄糖醛酸酶有助于得到独立的孢子进行萌发,从而促进原生质体的形成。利用共转化的方式,可以同时将两个表达框整合到基因组上并实现基因表达。     

棉织物酶精练漂白同浴处理工艺

为了实现棉织物精练和漂白同浴进行,在酶精练时加入H<,2>O<,2>对织物进行处理,随后添加四乙酰乙二胺(TAED)以进一步激活H<,2>O<,2>进行漂白.酶精练和漂白同浴试验最佳处理工艺为:酶精练时添加H<,2>O<,2>3 g/L,精练结束后补充添加1g/L,TAED 4 g/L,漂白时间为60 min,工艺全过程均在低温条件下进行.织物处理后棉籽壳、蜡质和果胶质等杂质的去除率与传统精练、漂白工艺相当,其中棉籽壳的去除率达到88.06%.     

天然复合面包发酵剂的制备与性能分析

以来源于葡萄天然发酵液的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、乳酸明串珠菌(Leuconostoc lactis)和植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)制备一种优良的新型天然复合发酵剂以提高面包的烘焙品质。发酵剂中3株菌的最适配比为1∶1.5∶1.5,此时面包比容和硬度均优于普通酵母面包;采用质构仪(texture anylyzer,TA)、差示量热扫描仪(differential scanning calorimetry,DSC)以及固相微萃取-气相色谱-质谱联用(solid phase micro-extraction-gas chromatographic-mass spectrometry,SPME-GC-MS)技术,考察天然复合发酵剂面包的老化性能及风味。结果表明,天然复合发酵剂发酵能显著降低储藏期内面包芯硬度和老化焓,延缓面包老化,面包中挥发性风味物质的种类增加11种,相对含量提高4.81%;天然复合发酵剂在4℃储藏90 d后菌株存活率仍有81.78%。此发酵剂具有活菌数高、发酵能力强、货架期长且能显著改善面包品质和风味的优点。     

动态调控元件及其在微生物代谢工程中的应用

代谢工程是通过对代谢途径的设计、构建与优化,进行营养品、药品、生物燃料以及化工产品等各种生物基产品合成的关键技术。传统的改造策略如基因的敲除、弱化与过表达会造成代谢流的失衡,而利用微生物自身的调控方式和调控元件,构建合成调控元件,对代谢途径进行动态调控,可以平衡细胞生长与产物合成,从而实现高产量、高底物转化率与高生产强度的统一。利用微生物在转录水平对于外界环境以及胞内代谢物浓度的变化的响应机制,以及在转录后水平通过顺式及反式作用元件的调控,和在蛋白质水平通过途径酶的别构调节以及对蛋白质降解速率的调节,都能开发出相应的动态调控元件并对微生物的代谢进行动态调控。本文分别从转录水平、转录后水平及蛋白质水平3个层次总结了目前常见的一些动态调控元件,并对其在微生物代谢工程中的应用进行了介绍。     

共表达分子伴侣提高漆酶在毕赤酵母中的分泌

通过共表达分子伴侣的策略提高漆酶在毕赤酵母中的产量。前期基于Pichia pastoris密码子偏好性,合成了来源于Cerrena sp. WR1的漆酶基因,克隆至pPIC9K,转化Pichia pastoris GS115,得到重组菌株PP-L。在PP-L中,分别过量表达蛋白质折叠(BIP、ERO1)、囊泡运输(SEC53、SEC1)、胁迫应激(HAC1、GCN4)相关的6种分子伴侣。结果显示,共表达这6种分子伴侣对分泌表达漆酶的菌株PP-L的正常生长没有影响;共表达BIP使重组菌胞外酶活提高359%,共表达ERO1胞外酶活反而降低22%;共表达其它4种分子伴侣对胞外酶活提高18%～53%。组合共表达BIP和HAC1的重组菌P1较PP-L胞外酶活提高了602%,酶活达到3 896 U/L。推测由于强化内质网中BIP水平进而提高了蛋白质折叠能力,从而提高其分泌效率。该研究结果将有助于发酵法生产漆酶的工业化。     

共表达抗氧化酶促进脂肪氧合酶在大肠杆菌中的表达

基于脂肪氧合酶(LOX)活性对宿主菌潜在的危害,分别共表达了超氧化物歧化酶和过氧化氢酶,以期提高铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa BBE来源的LOX在大肠杆菌Escherichia coli Rosetta (DE3)中的表达。将P. aeruginosa BBE超氧化物歧化酶基因sodB和sodM及E. coli过氧化氢酶基因katE克隆至pRSFDuet-1,分别得到表达质粒pRSF-sodB,p RSF-sodM和p RSF-katE,将上述表达质粒转化至表达LOX的重组大肠杆菌N6,得到菌株N6-B,N6-M和N6-K。在20℃和1 mmol/mL异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)条件下诱导70 h,N6-B、N6-M和N6-K胞内外LOX总酶活分别为21.6、28.1和7.1 U/mL,其中N6-B和N6-M较对照菌株N6(11.8 U/mL)提高了83%和138%。通过正交实验确定LOX较优的诱导表达条件为:IPTG浓度2 mmol/mL,诱导菌体浓度(OD600)2.5,诱导温度20℃。研究结果表明:共表达超氧化物歧化酶能有效促进LOX在大肠杆菌中的表达,为该酶高效异源表达研究提供了新思路。     

利用环糊精糖基转移酶转化合成AA-2G的研究

利用环糊精糖基转移酶(CGT-SL)对转化合成2-O-α-D-吡喃葡萄糖基-L-抗坏血酸(AA-2G)的条件进行考察。反应产物通过HPLC/LC-MS分析确定含有AA-2G。以便宜易得的可溶性淀粉和VC作为底物,在初始反应条件下AA-2G的产量为1.23 g/L。通过转化条件优化初步确定了转化反应的最优条件:最适温度15℃,最适pH 4.0,转化反应时间32 h,底物VC和可溶性淀粉的比例为2∶4,VC质量浓度为16 g/L,酶浓度为79 U/m L时,AA-2G的产量达到6.23 g/L,VC转化率为19.93%。     

代谢工程改造毕赤酵母生产葡萄糖二酸

葡萄糖二酸是一种具有重要生物功能的有机酸,为了实现微生物合成葡萄糖二酸的高效生产,异源表达来源于小鼠基因组的MIOX基因及Pseudomonas putida KT2440的udh基因,在毕赤酵母中构建葡萄糖二酸合成途径,实现了葡萄糖二酸的生成。通过在摇瓶水平进行优化,确定了最适碳源为葡萄糖(初始质量浓度60 g/L最优),最适初始pH为5.5,最优接种龄为24 h,最适接种体积分数为25%,重组毕赤酵母生成的葡萄糖二酸产量从最初的(566.36±16.98) mg/L提高至(967.60±3.90) mg/L。在此基础上,重组毕赤酵母在3 L发酵罐中放大培养,葡萄糖二酸的产量达到了(2.60±0.04) g/L。     

易错PCR法提高L-氨基酸脱氨酶全细胞转化L-异亮氨酸生产α-酮-β-甲基正戊酸效率

对奇异变形杆菌Proteus mirabilis中的L-氨基酸脱氨酶进行定向进化,利用易错PCR技术向基因中引入随机突变,建立突变文库来筛选可获得较高α-酮-β-甲基正戊酸产量的突变株。突变株7/23-6最适全细胞转化反应条件是以pH 8.5 Tris-HCl为缓冲液,用900 mmol/L L-异亮氨酸在30℃下进行催化反应21～24 h,其α-酮-β-甲基正戊酸产量可以达到102 g/L,底物转化率达到87%。与对照菌相比,α-酮-β-甲基正戊酸产量和底物转化率均提高了13%,热稳定性提高了36.7%。