蓝光对龙眼细胞培养及类黄酮代谢的影响

采用搅拌式生物反应器放大培养龙眼悬浮细胞,探讨蓝光对龙眼细胞生长及类黄酮积累的影响。基于已建立并优化的龙眼细胞悬浮培养体系,首先研究龙眼细胞在黑暗和蓝光的培养过程中,细胞生长量、类黄酮含量、细胞活力、培养液的底物消耗量等的变化情况。结果发现:龙眼细胞培养9 d后,蓝光的细胞干重比黑暗增长了0.28 g/L,类黄酮含量增长了0.77 mg/g。细胞培养前期蓝光的培养液蔗糖消耗速度慢于黑暗培养,此后蔗糖含量均稳定在2 g/L。培养过程中,蓝光培养的还原糖含量均高于黑暗培养,蓝光的磷酸盐的消耗量基本大于黑暗培养。其次,通过qPCR技术分析光信号转录因子DlHY5、调控基因DlPAP1及类黄酮途径合成基因DlCHS的表达差异。结果表明蓝光可能通过光信号转录因子DlHY5调控基因DlPAP1的表达,进而调控龙眼类黄酮代谢途径合成基因DlCHS的表达,从而导致类黄酮的积累。     

植物miR172家族成员进化与分子特性分析

为了解植物miR172家族成员的进化与分子特性,对mi Rbase数据库中37个物种的161个miR172前体序列和196个miR172成熟体序列进行进化规律分析,并对植物miR172家族的保守基序、二级结构和靶基因进行预测分析。结果表明:miR172家族成员分布的37个物种都是被子植物,被子植物很可能是miR172家族进化来源的祖先。进化分析表明,植物miR172家族成员序列相似性是其聚类的首要影响因素,其次才是物种差异的影响。植物miR172家族成员成熟体序列分析表明,5p臂上形成的成熟体序列特异性较大,3p臂上形成的成熟体序列保守性较高。二级结构分析发现,植物miR172家族成员具有典型的茎环二级结构,且茎序列的保守性较环序列高。植物miR172前体序列包含1个UNCG环。靶基因预测分析发现,同一物种不同miR172成员的靶基因可能不同;不同物种miR172的靶基因也可能不同,AP2或AP2-like出现频率最高,其次还有arginine decarboxylase 1、Pathogenesis-related、MYB84等靶基因,表明其靶基因功能的多样性。     

金花茶松散型愈伤组织诱导与悬浮细胞系建立

采用组织培养及显微观察技术,以金花茶植株茎段、叶片、花药及离体培养的金花茶体细胞胚为试验材料,对松散型愈伤组织的获得及悬浮细胞系的建立进行了研究。结果表明:在黑暗条件下,以金花茶体细胞胚切块为外植体,在MS+KT 0.5 mg/L+NAA 8.0 mg/L+硝酸银5mg/L+蔗糖30 g/L培养基上诱导出愈伤组织后,将其转接到该诱导培养基上连续培养3个月,最后从培养物中挑选状态良好的松散型愈伤组织在分别含有肌醇与硝酸银的2种培养基上交替培养,可以获得金花茶松散型愈伤组织;方差分析表明:蔗糖添加量、肌醇添加量及硝酸银添加量均对金花茶悬浮培养液细胞密度有显著影响且后两者分别与光照条件存在相互作用;将松散型愈伤组织在分别添加100 mg/L肌醇与2.5 mg/L硝酸银的液体增殖培养基上交替培养,可以建立并保持金花茶悬浮细胞系。该研究结果可为金花茶大规模细胞培养提供科学依据。     

枇杷胚性培养物中2个ACS基因的克隆及生物信息学分析

以枇杷(Eriobotrya japonica)胚性培养物为材料,采用同源克隆法分离2个ACC合成酶(1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid synthase,简称ACS)基因家族成员EjACS-1和EjACS-2,GenBank登录号分别为GQ370519和GQ370520.结果显示:EjACS-1和EjACS-2的开放阅读框(ORF)长度均为1 464 bp,编码487个氨基酸.2个ACS基因之间核苷酸和氨基酸的一致性分别为92％和93％,且枇杷ACS与蔷薇科苹果亚科植物多种ACS高度同源.此外,从枇杷基因组DNA中分离了1个含有3个内含子、长度2 319 bp的基因gACS,GenBank登录号为GU180353.EjACS-1和EjACS-2的克隆,为今后研究枇杷组织培养中乙烯的作用机理奠定基础.     

朱顶红转录组De novo数据及功能注释分析

本研究利用Illumina高通量测序技术对PP333处理的朱顶红进行了RNA-seq测序,共获得26.91 Gb的数据,对其进行过滤去冗余后得到Unigene 106 684个,总长度为92 002 803 bp,平均长度为862 bp,N50为1 494 bp,GC含量为42.47%,Q20均达98%以上,表明测序质量较好。根据七大功能数据库比对结果,分别有53 853 (NR:50.48%)、29 732 (NT:27.87%)、35 889 (SwissProt:33.64%)、42 221 (KOG:39.58%)、40 258(KEGG:37.74%)、12 186 (GO:11.42%)以及42 559 (InterPro:39.89%)个Unigene获得功能注释。根据Nr注释结果,可匹配到物种为油棕、海枣、小果野芭蕉、莲等。在KOG注释中通用功能和预测占比最高。按GO功能分类,可分为生物过程、细胞组成、分子功能三类,52个分支,大量Unigene与代谢过程、细胞过程及单生物过程相关。按照KEGG功能分类,分为6类,21个功能组,大量Unigene与代谢相关,占比60.39%。本研究结果为朱顶红的矮化机理研究及其基因挖掘提供依据。     

基于SSR荧光标记构建睡莲核心种质

采用SSR荧光标记技术对240份睡莲资源进行遗传多样性分析;利用Structure软件分析其群体结构,采用主成分分析和聚类分析进行验证;基于最小距离逐步取样法构建核心种质并进行t筛选验证。结果表明,16对SSR荧光引物共检测到205个等位基因,平均Shannon’s信息指数(I)为0.2036,Nei’s基因多样性指数(H)为0.1168,有效等位基因数(N_e)为1.1697,表明睡莲的遗传多样性丰富。Structure软件分析结果显示最优的群体数K值为3,群体间有少量种质混杂;群体结构分析将240个睡莲品种(种)分为3个类群。采用最小距离逐步取样法,按70%、65%、60%、55%、50%、45%、40%、35%、30%、25%、20%、15%和10%的比例取样,各个核心子集遗传多样性指数总体上变化不明显;最终确立了15%的取样比例,包含36个睡莲品种(种)核心种质,其中Shannon’s信息指数(I)保留率为117%,Nei’基因多样性指数(H)保留率为118%,有效等位基因数(N_e)保留率为102%。t检验结果表明,构建的包含36个睡莲...     

龙眼体胚发生早期miR166初级体的克隆与表达分析

为了解龙眼miR166初级体基因Pri-miR166 S53结构特点及其前体和成熟体在龙眼体胚发生早期的表达模式,采用SMART~(TM) RACE试剂盒和PCR扩增技术克隆龙眼体胚早期miR166基因的初级体(Pri-miR166 S53),确认其转录起始位点,并预测其含有的潜在ORF;利用龙眼基因组数据库提取其启动子序列,预测其含有的顺式作用元件;用实时荧光定量PCR对龙眼体胚发生早期及不同激素处理下的胚性愈伤组织中miR166基因的前体(Pre-miR166 S53)和成熟体(miR166a.2)表达模式进行分析。结果表明:获得长317 bp的Pri-miR166 S53基因初级体序列,对其进行翻译,得到一条长13个氨基酸序列的miPEP(MLCFVDALFLIST)。利用生物信息学软件分析Pri-miR166 S53基因的启动子序列发现,除了具有TATA/CAAT-box外,还含有生长素、脱落酸、乙烯、水杨酸、茉莉酸甲酯及spl、HSE等特异作用元件。实时荧光定量PCR分析表明,在2,4-D调控的龙眼体胚发生早期过程中,从胚性松散型愈伤组织发育到球形胚的过程中,Pri-miR166 S53基因的前体pre-miR166 S53和成熟体miR166a.2都表现为下调趋势;而在无2,4-D调控的龙眼体胚发生早期中,pre-miR166 S53和miR166a.2表达模式不同。此外,pre-miR166S53随ABA和乙烯处理浓度升高呈下调表达,而对不同浓度2,4-D处理无应答;miR166a.2随2,4-D、ABA处理浓度升高呈下调表达,而在乙烯处理下呈上调表达。上述研究结果提示miR166前体和成熟体在对外源激素应答的模式上并不呈简单线性相关,可能存在多层次、多方位的调控。     

龙眼miR397家族成员分子特性及其在体胚发生早期的表达分析

【目的】探讨龙眼miR397家族成员的分子特性及其在龙眼体胚发生早期的表达模式。【方法】以‘红核子’龙眼胚性愈伤组织为材料,通过对龙眼miR397前体序列二级结构分析、进化树构建、靶基因预测与裂解位点验证、以及龙眼miR397a在龙眼体胚发育早期和不同激素浓度处理下的表达规律进行分析。【结果】龙眼miR397前体序列5端臂上可生成两个序列高度重合的成熟体序列dlo-miR397a和dlo-miR397,二者仅有5端两个碱基TC之间的差异,前体能形成稳定的茎环结构;进化树分析发现龙眼miR397前体与桃、可可、脐橙等亲缘关系较近,处于同一分支,龙眼miR397与拟南芥、甜橙、葡萄等亲缘关系较近,处于较为保守的同一分支,miR397家族成员较前体序列在进化上更为保守。靶基因预测表明龙眼miR397家族主要靶向调控漆酶基因家族和一条姐妹染色单体粘连蛋白(dlo_039206.1)。裂解位点验证发现靶基因姐妹染色单体粘连蛋白的裂解位点,但位于预测区间外。miR397a在体胚发生过程中对于靶基因姐妹染色单体粘连蛋白的调控模式在0～3 d较为一致,均为下调表达,6～12 d为显著上调表达,且二者呈典型的负调控关系。龙眼miR397a在不同浓度2,4-D与GA3激素处理下均出现下调表达趋势,而靶基因姐妹染色单体粘连蛋白则在激素处理下的表达趋势并不明显,可能由于靶向裂解位点在预测区外所致。【结论】龙眼miR397a可能在龙眼体胚发生早期的6～12 d,通过靶向调控姐妹染色单体粘连蛋白影响龙眼体胚发生早期形态建成。龙眼miR397家族在进化上较为保守,其靶基因主要靶向调控龙眼漆酶家族和姐妹染色单体粘连蛋白。龙眼miR397a在不同浓度2,4-D与GA3激素处理下均出现下调表达趋势,表明其在龙眼体胚发生早期可能通过激素信号传导参与龙眼体胚发生早期形态建成。     

“台农甜蜜桃”胚性愈伤组织SOD基因家族的克隆与序列分析

以“台农甜蜜桃”胚性愈伤组织为材料，采用RT-PCR和RACE法，首次从台农甜蜜桃中克隆出较为完整的包括Fe-SOD、Mn-SOD、Cu/Zn-SOD 3类型20条的SOD基因家族的全长序列，各成员核酸长度范围在858~1 234bp之间，共编码4种不同的蛋白。生物学分析学分析表明，SOD家族蛋白均为稳定的跨膜蛋白，均含有SOD典型的保守结构域，且在进化上高度保守，但在磷酸化位点上各蛋白差异较大，且3′UTR及5′UTR均具有多态性，可能通过以丝氨酸为主的磷酸化方式，改变酶活性及蛋白构象来参与对桃生长发育的调控。     

龙眼胚性愈伤组织DlRan3A和DlRan3B基因启动子的克隆及其生物信息学分析

植物Ran蛋白与核质运输、微管形成等过程密切相关。通过Tail-RCR结合接头连接介导PCR法克隆了龙眼胚性愈伤组织(Embryogenic callus,EC)Ran家族DlRan3A和DlRan3B基因的5′调控序列,长度分别为1276和714 bp。结合生物信息学法,分析启动子的转录起始位点和顺式作用元件。结果表明:龙眼EC DlRan3A和DlRan3B基因启动子分别存在1处和3处转录起始位点,且除了含有TATA box和CAAT box等基本顺式作用元件外,还含有多个光响应元件、激素应答元件、防御与逆境胁迫响应元件等。龙眼EC DlRan3A和DlRan3B启动子转录活性可能受到光、激素信号及逆境胁迫因素的诱导,在龙眼体胚发生过程中的信号转导应答过程中发挥重要作用。此外,在DlRan3A启动子区预测到1个长度为214 bp的CpG岛,为后续研究该基因启动子甲基化水平及分子调控机制提供了线索。龙眼EC Ran基因启动子的克隆与生物信息学分析有助于揭示Ran在体胚发生过程中的作用。