日本结缕草ZjZFN1基因对拟南芥的转化及其耐旱性分析

锌指蛋白在植物干旱胁迫中起重要作用,尽管已经在各种植物中克隆并鉴定了编码这些蛋白质的基因,但是它们在日本结缕草中的功能和潜在的转录机制还不清楚。通过花序侵染法将ZjZFN1基因及其启动子转化拟南芥,并通过草铵膦/潮霉素抗性筛选和PCR鉴定,获得转基因株系。ZjZFN1的启动子能够驱动GUS基因的表达,在甘露醇处理下的GUS基因表达水平显著高于对照;在拟南芥中过表达ZjZFN1降低了种子发芽率,减弱了植物对干旱胁迫的适应性和植物在干旱胁迫下的生长状况;干旱处理后,转基因植株中的丙二醛含量高于野生型植株,而脯氨酸含量显著低于野生型植株;实时荧光定量分析表明对过表达ZjZFN1的拟南芥进行干旱处理后,POD、SOD、P5CS、LEA的表达水平降低,而APX的表达水平升高。ZjZFN1基因的过表达可减弱植物的耐旱性,为进一步开发利用该基因奠定基础。     

沟叶结缕草ZmPSY基因启动子对拟南芥的转化及功能分析

利用染色体步移法克隆得到沟叶结缕草(Zoysia matrella)ZmPSY基因的启动子序列。将ZmPSY起始密码子上游的1512bp的启动子序列与GUS基因融合,构建了ZmPSYpro::GUS载体,并利用农杆菌介导的方法转化拟南芥。经潮霉素筛选和PCR鉴定,共获得8个转基因株系。GUS染色结果表明,ZmPSY基因启动子能够驱动GUS基因在拟南芥中表达,且集中在茎叶部位。利用荧光定量技术(qRT-PCR)分析了外施激素和非生物胁迫处理下GUS基因的表达量,结果表明:5μM ABA可诱导GUS表达增强,10μM MeJA和黑暗处理抑制GUS表达,而100μM GA3处理无显著变化。研究成功克隆ZmPSY基因的启动子序列,并证明ZmPSY基因的表达可受ABA、MeJA和黑暗处理的调控,为深入研究ZmPSY基因的转录调控提供了依据。     

青绿苔草(Care breviculmis)愈伤组织诱导与再生体系的建立

为建立青绿苔草高效的再生体系,本研究以青绿苔草的种子为外植体,探究不同植物激素配比对愈伤组织诱导、愈伤分化和生根的影响。结果表明:MS+1.5 mg·L^-1 NAA+0.5 mg·L^-1 6-BA+2.0 mg·L^-1 2,4-D为诱导愈伤的最佳培养基,诱导率可以达到68.3%,愈伤表现为松散的黄色颗粒;MS+1.0 mg·L^-1 NAA+1.0 mg·L^-1 6-BA为最佳分化培养基,分化率为93.8%,不定芽数量达到40个,长势良好;不定芽在1/2 MS培养基中生根效果最好,其根长、株高和生根数量均显著高于其他处理。本研究建立了高效的青绿苔草再生体系,为研究青绿苔草的遗传转化及应用生物技术育种奠定了基础。     

芽前除草剂和氮肥联合施用对纯雌野牛草草坪建植的影响

采用大田试验方法,研究了芽前除草剂氨氟乐灵和氮肥尿素对纯雌野牛草（Buchloe dactyloides）草坪建植的影响。第一次杂草调查结果表明氨氟乐灵处理显著降低野牛草分株的移苗死亡率、对草坪建植初期杂草封杀显著有效,虽然第二次杂草调查结果欠佳,但氨氟乐灵对杂草仍有一定的控制效果,推荐使用浓度在600 ～ 1 200 g·hm^-2。其次,氨氟乐灵和尿素的结合处理提高了纯雌野牛草草坪的生物量、盖度以及降低了杂草总数量和杂草物种数,双因素方差分析结果表明氨氟乐灵相较于尿素对纯雌野牛草草坪建植的影响更大。最后,通过聚类分析发现氨氟乐灵和尿素结合处理中A3B2和A2B3的效果相近且最优。     

日本结缕草ZjNAC2转录激活验证及互作蛋白的初步筛选

为了进一步探究ZjNAC2在胁迫响应中的作用机制,本试验运用酵母双杂技术筛选与日本结缕草（Zoysia japonica）中的ZjNAC2转录因子相互作用的蛋白。通过克隆获得了日本结缕草ZjNAC2的基因序列并成功构建了诱饵载体pGBKT7-ZjNAC2,同时构建高质量的日本结缕草的均一化酵母杂交全长文库。通过酵母双杂筛库的实验筛选到30个阳性菌落,其测序表明获得了20个与ZjNAC2互作的蛋白。NR（Non-redundant protein sequences）注释分析结果显示,20个注释基因NR同源物种比对到9个物种,其中比对到高粱（Sorghum bicolor）中的注释基因最多。GO（Gene Ontology）注释结果表明这些基因可分为细胞组分、分子功能和生化过程3大类。本研究初步筛选到4个与抗病、植物生长发育过程相关的候选互作蛋白,为进一步探究ZjNAC2在日本结缕草中的下游调控机制奠定了基础。     

草地早熟禾荧光定量PCR分析中内参基因的筛选

为筛选出草地早熟禾实时荧光定量中的最适内参基因,利用实时荧光定量PCR技术,分析检测6个传统内参基因ACT、GAPDH、UBQ、EF-1α、18s rRNA和β-tublin在草地早熟禾不同组织器官、叶片不同发育期、非生物胁迫和不同激素诱导下mRNA的表达差异情况。利用geNorm、NormFinder和BestKeeper软件综合评价6个候选内参基因的表达稳定性。结果表明,在不同组织、叶片不同发育期、激素诱导和非生物胁迫下,候选内参基因的表达稳定性存在差异。GAPDH在草地早熟禾不同组织器官中表达最为稳定;EF-1α在非生物胁迫下表达最为稳定;不同激素下首选β-tublin;在叶片不同发育期ACT表达最为稳定。综上所述,通过筛选出不同条件下适宜的内参基因不仅有助于提高草地早熟禾基因表达分析的准确性,也为早熟禾属植物其他内参基因的开发提供了理论参考。     

扦插部位、时间和IBA浓度对‘紫光’狼尾草(Pennisetum alopecuroides ‘Ziguang’)茎秆扦插成活的影响

以‘紫光’狼尾草（Pennisetum alopecuroides ‘Ziguang’）为材料,分别研究了扦插部位、扦插时间和吲哚丁酸（indolebutyric acid,IBA）浓度对其茎秆扦插幼苗生长状况的影响。结果表明,不同扦插部位产生幼苗的生长状况：下部芽苞 > 中部芽苞 > 上部芽苞;八月上旬至十月下旬,随着扦插时间的变化,母株茎秆中可溶性糖含量曲线呈现“双峰型”变化,淀粉含量则持续增加,其幼苗成活率、苗高、鲜干重、最长根长与生根数等均呈现先升高后降低的趋势,并在8月22日左右扦插时幼苗的生长状况最佳,成活率为45%;在0,0.1%,0.2%,0.3%,0.5%,1% IBA处理条件下,随着激素浓度的增加,其茎秆扦插幼苗成活率、苗高、鲜干重、最长根长与生根数等均呈现先升高后降低的变化趋势,并在0.3% IBA处理扦插茎段时幼苗的生长状况最佳。本试验为狼尾草的茎秆扦插实际生产提供了理论依据。     

蓝莓VcMYB启动子克隆及其功能初步分析

为探究VcMYB启动子在转录过程中如何发挥调控作用,利用FPNI-PCR法从蓝莓中克隆到调控原花青素合成相关的转录因子VcMYB的768 bp启动子序列。用PLACE和Plant CARE在线启动子预测工具分析了该启动子,结果表明其序列中存在启动子的基本元件CAAT-box和TATA-box,还包含一系列的响应元件,如光响应元件、低温响应元件、防御与胁迫响应元件和茉莉酸甲酯响应元件等。为进一步分析该启动子的功能,构建了该基因启动子与GUS基因融合的植物表达载体VcMYBpro::GUS,并用农杆菌转化拟南芥。对转基因拟南芥进行GUS组织化学染色分析,结果表明该VcMYB启动子能驱动GUS基因在转基因拟南芥中表达,并且经脱落酸(ABA)、4℃低温、LED光照和持续光照处理后,转基因拟南芥中GUS的表达活性增强,推测该基因受ABA、低温和光的调控。     

基于SSR标记的苔草种质遗传多样性分析

苔草属(Carex L.)植物为莎草科多年生草本,在园林绿化、畜牧业生产、生态修复等方面发挥着越来越重要的作用。为了了解新西兰苔草品种间的遗传多样性及与国内苔草的地域差异,对其进行分子标记分析。本研究利用筛选得到的10对SSR引物对12份苔草材料(包括10份新西兰引进品种)进行遗传多样性分析,结合聚类分析等揭示苔草材料之间的遗传多样性。结果显示,10对SSR引物最终扩增出91条多态性条带,据此建立的指纹图谱显示Ctcp016引物可以一次性鉴别12份苔草样品;多态性比率为97.8%,平均每条引物扩增出8.27条,多态性信息含量(PIC)在0.140~0.260之间,平均多态性信息含量为0.220,平均遗传距离值为0.428;12份参试苔草资源的观测等位基因数(Na)、有效等位基因数(Ne)、基因多样性指数(H)以及Shannon信息指数(I)平均值分别为1.976、1.350、0.226、0.368,表明各苔草样品之间的遗传多样性处于较高水平;非加权组平均(UPGMA)聚类系统发生树在遗传距离为0.428时可将12份苔草分为3类,地域对苔草遗传信息无明显影响。本研究表明利用SSR标记可以有效地对苔草遗传多样性及群体结构进行分析,并可构建苔草遗传图谱,为以后的研究提供丰富的标记来源,有助于推动苔草分子标记辅助育种工作,为进一步开发利用苔草资源提供帮助。