基孔肯雅病毒的实时荧光RT-PCR检测方法研究

目的:建立基孔肯雅病毒的荧光定量PCR检测方法.方法:人工合成基孔肯雅病毒部分有代表性的序列核酸作为阳性对照模板,设计几组实时荧光PCR引物、探针及反应体系,摸索出最佳反应体系条件.结果:建立的基孔肯雅病毒的实时荧光PCR检测方法最佳反应体系为:正向引物CHIK-FP终浓度500 nM,反向引物CHIK-RP终浓度1000 nM,探针CHIK-Probe终浓度250 nM;扩增程序为:50℃10 min,95℃ 10 min,95℃10 s→62℃30 S 45次循环.结论:该方法灵敏度高、特异性强,适用于基孔肯雅病毒的快速检验.     

TaqMan MGB探针实时聚合酶链反应检测白纹伊蚊体内登革病毒

目的初步研究TaqMan MGB探针实时聚合酶链反应（TaqMan MGB Real-time PCR）检测白纹伊蚊登革病毒的敏感性，建立一种敏感、特异、重复性好的登革病毒（Dengue virus，DV）鉴定方法。方法在实验室使雌性白纹伊蚊人工感染Den-2型病毒，设不同的感染蚊虫浓度（只／500μl或只／1000μ1）和不同的分组方法（不加未染毒的蚊虫、分别用未染毒的实验室饲养的雌性白纹伊蚊补加到每份标本10、25、50只／组），利用一步法和二步法TaqMan MGB PCR检测，根据荧光信号判断结果。结果二步法TaqMan MGB PCR可检测到标本中感染蚊虫的最低浓度为2只／500μl和3只／1000μl，一步法TaqMan MGB PCR可检测到标本中感染蚊虫的最低浓度为5只／500μl，蚊自身的RNA对登革病毒RNA的检测敏感性并无明显的影响。结论TaqMan MGB探针检测白纹伊蚊体内的DV敏感度高，特异性好，是白纹伊蚊携带登革病毒指数较理想的监测方法，标本较好的处理方法为500μl标本处理液研磨20～30只／组，TaqMan MGB Real-time PCR最好采用二步法。     

广东省1991-2004年乙型流感监测结果分析

[目的]分析1991—2004年广东省乙型流感病毒抗原变异和流行情况。[方法]用9~11日龄鸡胚和(或)MDCK细胞分离流感病毒,病毒鉴定用常量红细胞凝集抑制法(HI);人血清流感抗体检测用微量半加敏红细胞凝集抑制法。[结果]广东省一直有乙型流感流行,并从人群中分离到流感病毒2 916株,乙型流感病毒占23.3%。乙型流感病毒两大谱系交替为优势株,除1994、1997及2002年以Victoria系为主外,其余各年以Yamagata系为主。乙型流感病毒抗原性不断发生漂移,历年一般人群血清乙型流感抗体检测阳性率在28.3%~73.9%。[结论]1991—2004年广东省乙型流感病毒存在差异较大的两个谱系,病毒谱系的轮换和抗原漂移导致乙型流感不断流行。     

用多重PCR快速检测登革病毒并分型

目的 建立一种多重聚合酶链反应(PCR)方法，对不同型别登革病毒进行快速检测及分型。方法 采用4种型别登革病毒通用的外侧引物进行逆转录PCR(RT—PCR)反应，继用4对(5种)型特异引物在单管内进行巢式PCR，依据扩增产物的片段大小进行分型。结果 采用多重PCR，扩增出482、119、290及392bp的特异片段，分别代表登革病毒1～4型。结论 该方法快速、敏感、特异，有一定的推广应用价值。     

广东省严重急性呼吸综合征病毒的分离和鉴定

目的 分离和鉴定引起广东省非典型肺炎的病原体。方法 收集非典型肺炎患者的各种临床标本，用狗肾传代细胞(MDCK)进行病原体分离，并运用血清学和分子生物学方法进行鉴定。结果 用MDCK细胞从非典型性肺炎患者标本中分离到病毒，用SARS病毒聚合酶基因的特异引物，通过巢式聚合酶链反应(nest RT-PCR)，扩增出一个279nt的片段，序列分析结果显示，该序列和目前已知的冠状病毒有39％-65％同源性，和来源于不同地区分离的SARS冠状病毒株(中国北京、香港、台湾和德国、意大利等)在同一个位置(第12个碱基)仅有一个碱基不同，由a→t。间接免疫荧光抗体检测显示，该病毒能够和非典型肺炎患者的恢复期血清呈特异的抗体反应。结论 这种新的冠状病毒是引起广东省非典型肺炎的病原，且能够用MDCK细胞进行分离。     

非洲籍输入性基孔肯雅热一例的实验室诊断

基孔肯雅热是由基孔肯雅病毒引起,经伊蚊叮咬传播,以发热、关节疼痛、皮疹和轻度出血为主要特征的病毒性急性传染病.基孔肯雅病毒是单股RNA病毒,属于披膜病毒科甲病毒属.1952年研究人员发现基孔肯雅热在坦桑尼亚流行,并从严重关节炎患者血液中分离出基孔肯雅病毒.1956年,Ross[1]从急性期患者的血液及野外捕获的埃及伊蚊体内分离出基孔肯雅病毒.近年来,本病在东非海岸、印度洋岛屿、印度及东南亚地区流行,导致超过200 万人感染发病,且流行地区不断扩大,发病人数不断上升[2].     

登革病毒重组膜蛋白抗原的制备与应用

目的在原核系统中表达登革病毒1~4型膜蛋白B区的型特异性抗原,开发登革病毒感染系列酶联免疫诊断试剂盒。方法利用PCR技术从登革病毒标准株扩增膜蛋白B区抗原基因,通过酶切消化后连接到表达载体上,转化大肠埃希菌BL21 StarTM(DE3),经IPTG诱导表达,表达产物用液相层析法纯化;并用Western Blot(WB)及ELISA法对表达产物的抗原性进行检测。用重组抗原制备登革病毒抗体酶联免疫诊断试剂,用该试剂对广东省登革热监测血清库样本的登革病毒抗体测定,并与进口登革IgM抗体检测试剂(澳大利亚PanBio)进行对比分析。结果表达产物具有较高的浓度、纯度和良好的活性。重组抗原对16份登革病毒分离阳性血清中的登革病毒IgM抗体有良好的抗原反应性(A均≥0.29,cut-off值为0.2);对2004年中山市登革热疫情65份患者血清样本的IgM、IgG检出率均达100%(65/65、28/28)。用重组抗原制备的试剂检测了617份登革热疑似病例血清中的登革病毒IgM抗体,阳性率为70.66%,其中对123例临床确诊登革热病例血清的IgM阳性率为90.24%;检测1 675份登革热监测血清样本的IgG抗体,阳性率为9.19%;用该试剂与进口试剂分别对34份临床确诊的登革热病例的血清样本进行检测,两者IgM抗体阳性率分别为91.18%、73.53%。结论制备的登革病毒重组抗原可用于研制登革病毒感染酶联免疫诊断试剂盒。     

广东省SARS冠状病毒分离株S基因全序列分析

目的 测定并分析广东省传染性非典型肺炎病人标本中分离到的严重急性呼吸综合征(SARS)冠状病毒的S基因全序列。方法 选取3株来自中山市、广州市、江门市传染性非典型肺炎病人的SARS冠状病毒分离株，设计8对相互嵌套的S基因特异引物扩增病毒的S基因，直接进行PCR产物测序，将所测的序列与从GemBank上获得的世界各地10株SARS冠状病毒分离株的S基因序列用DNASTAR软件包进行基因变异分析。结果 3株毒株经P(R扩增后，均可获得大小分别为513、589、527、509、621、501、578、678bp的基因片段，测序并拼接可获得一长3768个碱基S基因全基因序列，编码1256个氨基酸；基因序列比对结果显示，与世界各地10株毒株比较，核苷酸和氨基酸的最大同源性在99．7％～100．0％和99．2％～99.9％之间，其变异主要发生在S蛋白的S1片段。结论 SARS冠状病毒的S蛋白是比较保守的．但S1片段上某些位点的变异可能是病毒的毒力不同的主要原因。     

广东省1995年登革热病原学和血清学调查结果分析

对广东省1995年疑似登革热（DF）患者的血清142份，其中以C6／36细胞进行病毒分离62份，以IFAT检测IgG抗体80份。结果，DI型病毒分离阳性率为51．61％（32／62），1－3天分离率最高，达714～90．0％，为病毒分离最佳期；IgG抗体阳性率为575％（46／80），于第4天可检出，11－14天阳性率最高，达81．82％，D1－D4型IgG抗体滴度在13－14天均可达1：640，检测IgG抗体第一相血清以5－7天较好。并提示，D1－D4型抗体滴度高低无法区分登车热流行型别，应以病原学分离鉴定为准，C6／36细胞分离病毒出现细胞病变的仅占62．5％，说明不能仅以C6／36细胞出现病变为阳性判断标准，应加用其他方法进一步的鉴定。