外源性野生型p53基因在两个肺腺癌细胞系中表达及对p16和p21基因的调控

目的 探讨p53基因在肺癌细胞周期中的作用机制，以及裸鼠体内基因治疗的作用。方法 用以腺病毒为载体的野生型p53基因pAdCMV-p53(Ad-p53)感染高转移肺腺癌95D细胞系和高浸润肺腺癌L-18系，对感染前后各细胞系的细胞生长曲线、p53、p16和p21基因的表达以及调亡进行分析。此外，用Ad-p53对两细胞系进行了裸鼠体内感染实验。结果 体外实验中，导入p53基因细胞系的生长均得到抑制，并且最终都出现凋亡，感染后的细胞中p53和p21基因的mRNA表达量明显增高，p16基因的mRNA表达量则无明显变化。p53基因治疗后的裸鼠，其中95D细胞系的肿瘤全部消失；L-18细胞系的腹腔注射组肿瘤全部消失，而皮下注射组无明显变化。结论 p53基因是一个有效的肿瘤抑制基因，其诱导细胞凋亡的途径与p16基因不同。腺病毒介导的野生型p53基因可以有效地控制肺癌细胞的发展和转移。     

pcDNA3.1(+)GDNF真核表达载体的构建及其在真核细胞中的表达

目的：构建pcDNA3.1( )胶质细胞源性神经营养因子（GDNF）真核表达质粒并了解其在真核细胞内的表达。方法：将GDNF逆转录聚合酶链 式反应（RT－PCR）产物克隆至pcDNA3.1( ）真核表达载体上,经酶切鉴定及测序分析并以FuGene6介导法转染真核细胞,了解其在细胞内的表达及春表达蛋白折生物学活性。结果：RT－PCR产物为640bp特异性片段,pcDNA3.1( )GDNF重组体经酶切后分别出现640bp和300bp片段,测序分析与文献报道结果完全一致,表明重组pcDNA3.1( )GDNF表达质粒克隆成功,可见pcDNA3.1( )GDNF质粒在真核动物细胞中得到表达,GDNF蛋白能刺激含多巴胺的细胞生长,表明重组质粒能在真核动物细胞中出具有活性的GDNF蛋白。结论以FuGene6介导pcDNA3.1( )GDNF质粒传染真核细胞为基因治疗帕金森病奠定了一定基础。     

东北地区7个少数民族群体中ApoE基因单核苷酸多态性的研究

目的研究东北地区少数民族群体ApoE基因4个单核苷酸多态性的特点及群体之间的差异。方法应用PCR-RFLP方法对东北地区7个少数民族群体共216个健康个体该基因中4个SNP位点进行检测。结果2440位点在所有群体中都存在多态性,且各民族间存在差异;73、2907、3106位点不存在多态性。结论东北少数民族中73、2907、3106位点不具有多态性,2440位点杂合度为0．177,与国外文献报道及国际SNP数据库比较有很大的差异。     

达斡尔族mtDNA D环多态性研究

本文应用PCR技术扩增mtDAN D环 465bp高变区DNA片段,分别进行6种限制性内切酶10个位点的RFLP分析,结果共产生14种限制性类型,根据Nei.M公式计算出达斡尔族人mtDNAD环平均核苷酸歧异频率为0.0541,为D环区较mtDNA平均核苷酸歧异频率明显增高提供实验依据。     

血管平滑肌细胞增殖与转化生长因子β/smads的表达

目的:观察增殖和分化两种血管平滑肌细胞表型改变与转化生长因子β/smads信号传递的关系。方法:实验于2003-09/10哈尔滨医科大学医学遗传学研究室完成。取体质量200g左右的健康雄性SD大鼠,常规胶原酶消化法原代培养大鼠血管平滑肌细胞。用体积分数为0.2和0.05(去血清培养)胎牛血清和的Dulbecco改良的Eagle培养基,37℃,体积分数0.05CO2进行培养,2.5g/L胰酶消化传代。血管平滑肌细胞经锥虫蓝染色,存活细胞数在98%以上。形态学上出现典型的“峰和谷”样生长状态,抗平滑肌特异α-肌动蛋白免疫组织化学染色阳性。取3～8代细胞用于实验。流式细胞分析检测不同表型血管平滑肌细胞增殖能力,蛋白质印迹分析方法检测血管平滑肌细胞分化相关基因平滑肌特异性肌动蛋白表达变化,反转录聚合酶链反应和细胞免疫荧光方法检测转化生长因子βI型受体,smad2,smad3,smad4和smad7的表达变化。结果:①流式细胞分析及蛋白印迹分析方法检测发现,去血清培养后,原代培养大鼠血管平滑肌细胞增殖能力下降;DNA合成前期细胞明显增加犤(52.42±2.35)%犦,细胞分化基因平滑肌特异性α-肌动蛋白明显表达。体积分数为0.2胎牛血清培养后,大鼠血管平滑肌细胞增殖旺盛,DNA合成前期细胞数相对较少犤(17.23±1.58)%犦,细胞分化相关基因平滑肌特异性肌动蛋白表达明显下调。②反转录聚合酶链反应和细胞免疫荧光方法检测发现,去血清培养后的分化表型平滑肌细胞中,转化生长因子βI型受体表达增加,smad2和smad3表达无明显变化,smad4表达增加,smad7表达下降。而高血清培养诱导平滑肌细胞转化为增殖表型后,转化生长因子βI型受体表达下降,smad4表达下降,抑制型smad7表达增加,smad2和smad3表达无明显变化。结论:转化生长因子β/smads表达与血管平滑肌细胞表型状态密切相关。血管平滑肌细胞分化时,可能通过转化生长因子βI型受体/smad4调控细胞分化功能;而血管平滑肌细胞增殖时,细胞则可能通过smad7信号传导通路发挥作用。提示转化生长因子β/smads在血管平滑肌细胞由合成表型逆转为分化表型的分子调控中发挥作用。     

药物基因组学的研究进展

随着“人类基因组计划”研究的迅猛发展，人类全基因组序列测定已经完成，大批人类基因相继被发现，人类基因组研究获得大量信息，“药物基因组学”应运而生。药物基因组学就是应用基因组学的信息和研究方法，通过分析DNA的遗传变异和监测基因表达谱，以阐明药物反应差异的遗传学本质。这不仅有利于根据药物代谢和药物反应的遗传学特点指导合理用药，而且有利于开发和设计新的药物。本文综述了药物基因组学的研究进展。     

载脂蛋白AI—CⅢ基因区域DNA多态性与动脉硬化性脑梗塞关系…

为探讨载脂蛋白ＡＩ－ＣⅢ基因区域ＤＮＡ多态性与动脉硬化性脑梗塞的关系，作者利用重组ＤＮＡ技术，对５９名正常血脂汉族个体和４４名动脉硬化性脑梗塞患者载脂蛋白ＡＩ－ＣⅢ基因区域ＤＮＡ多态频率和特征进行了分析，发现Ｓ２和Ｍ２２种多态性片段，正常人群等位基因频率为０．１５７和０．１９５，而在ＡＢＩ患者中分别为０．３６４和０．４８９。     

血管平滑肌细胞增殖与转化生长因子β／smads的表达

目的：观察增殖和分化两种血管平滑肌细胞表型改变与转化生长因子β／smads信号传递的关系。方法：实验于2003—09／10哈尔滨医科大学医学遗传学研究室完成。取体质量200g左右的健康雄性SD大鼠，常规胶原酶消化法原代培养大鼠血管平滑肌细胞。用体积分数为0．2和0．05(去血清培养)胎牛血清和的Dulbecco改良的Eagle培养基，37℃，体积分数0．05CO2进行培养，2．5g／L胰酶消化传代。血管平滑肌细胞经锥虫蓝染色，存活细胞数在98％以上。形态学上出现典型的“峰和谷”样生长状态，抗平滑肌特异α-肌动蛋白免疫组织化学染色阳性。取3～8代细胞用于实验。流式细胞分析检测不同表型血管平滑肌细胞增殖能力，蛋白质印迹分析方法检测血管平滑肌细胞分化相关基因平滑肌特异性肌动蛋白表达变化，反转录聚合酶链反应和细胞免疫荧光方法检测转化生长因子βⅠ型受体，smad2，smad3，smad4和smad7的表达变化。结果：①流式细胞分析及蛋白印迹分析方法检测发现，去血清培养后，原代培养大鼠血管平滑肌细胞增殖能力下降；DNA合成前期细胞明显增加[(52．42&;#177;2．35)％]，细胞分化基因平滑肌特异性α-肌动蛋白明显表达。体积分数为0．2胎牛血清培养后．大鼠血管平滑肌细胞增殖旺盛，DNA合成前期细胞数相对较少[(17．23&;#177;1．58)％]，细胞分化相关基因平滑肌特异性肌动蛋白表达明显下调。②反转录聚合酶链反应和细胞免疫荧光方法检测发现，去血清培养后的分化表型平滑肌细胞中，转化生长因子β1型受体表达增加，smad2和smad3表达无明显变化，smad4表达增加，smad7表达下降。而高血清培养诱导平滑肌细胞转化为增殖表型后，转化生长因子βⅠ型受体表达下降，smad4表达下降，抑制型smad7表达增加，smad2和smad3表达无明显变化。结论：转化生长因子β／smads表达与血管平滑肌细胞表型状态密切相关。血管平滑肌细胞分化时，可能通过转化生长因子βⅠ型受体／smad4调控细胞分化功能；而血管平滑肌细胞增殖时，细胞则可能通过smad7信号传导通路发挥作用。提示转化生长因子β／smads在血管平滑肌细胞由合成表型逆转为分化表型的分子调控中发挥作用。     

血管平滑肌细胞表型改变与肿瘤抑制基因p21WAF1和p53的关系

目的增殖表型血管平滑肌细胞中肿瘤抑制基因p21WAF1基因和p53基因表达可能具有对抗血管平滑肌细胞的增殖能力,观察血管平滑肌细胞表型变化与肿瘤抑制基因p21WAF1和p53的关系.方法实验于2003-09/10哈尔滨医科大学医学遗传学研究室完成.应用胶原酶消化法建立大鼠原代培养血管平滑肌细胞,去血清诱导体外培养血管平滑肌细胞分化.流式细胞分析检测不同表型血管平滑肌细胞增殖能力,反转录-聚合酶链反应和蛋白质印迹分析方法检测血管平滑肌细胞分化相关基因平滑肌特异性α-肌动蛋白和calponin表达变化,反转录-聚合酶链反应和蛋白质印迹杂交方法检测p21 WAF1和p53基因表达变化.结果去血清培养后,原代培养大鼠血管平滑肌细胞增殖能力下降,DNA合成前期细胞明显增加[(48.38±2.35)%],细胞分化基因平滑肌特异性α-肌动蛋白和calponin明显表达.肿瘤抑制基因p21WAF1和p53表达下降.在200 g/L血清培养后,大鼠血管平滑肌细胞增殖旺盛,DNA合成前期细胞相对较少[(28.80±1.58)%],细胞分化相关基因平滑肌特异性肌动蛋白和calponin表达明显下调,肿瘤抑制基因p21 WAF1和p53表达显著增加.结论肿瘤抑制基因表达与血管平滑肌细胞表型状态密切相关.提示某些病理性增殖过程中肿瘤抑制基因的大量表达可能与其对抗细胞增殖的功能相关,并可能在血管平滑肌细胞由合成表型逆转为分化表型的分子调控中发挥作用.     

信号转导分子smad4基因表达抑制体外培养人血管平滑肌细胞的增殖

目的：探讨细胞内转化生长因子β信号通路中信号转导分子Smad4与平滑肌细胞的增殖关系。方法：实验于2003-08／10在哈尔滨医科大学医学遗传学研究室完成。①取体质量200g左右的健康雄性SD大鼠，常规胶原酶消化法原代培养大鼠血管平滑肌细胞。用体积分数为0．2和0．05(去血清培养)胎牛血清和的Dulbecco改良的Eagle培养基，37℃，体积分数O．05 CO2进行培养，2．5g/L胰酶消化传代。血管平滑肌细胞经锥虫蓝染色，存活细胞数在98％以上。形态学上出现典型的“峰和谷”样生长状态，抗平滑肌特异α-肌动蛋白免疫组织化学染色阳性。取3～8代细胞用于实验。②观察项目：转染前后细胞增殖能力和细胞凋亡能力的检测应用流式细胞分析仪和脱氧核糖核酸末端转移酶介导的缺口末端标记法凋亡检测试剂盒完成。smad4的表达及部分与细胞周期调控相关基因(p16、细胞周期调控激酶4和细胞周期因子E)和细胞凋亡基因(半胱天冬酶2和半胱天冬酶3)表达变化应用免疫印迹法和荧光免疫组化方法检测。结果：①转染前后细胞增殖能力和细胞凋亡能力流式细胞分析仪和脱氧核糖核酸末端转移酶介导的缺口末端标记法测定结果：smad4基因过表达调控人血管平滑肌细胞增殖能力下降DNA合成前期细胞明显增加[(72．33&;#177;4．35)％]，正常培养细胞DNA合成前期细胞数相对较少[(45．88&;#177;1．58)％]。②smad4的表达及部分与细胞周期调控相关基因免疫印迹法和荧光免疫组化方法检测结果：转染后细胞凋亡能力增加；细胞周期抑制基因p16表达增加，细胞周期调控激酶4和细胞周期因子E表达下降，凋亡相关基因半胱天冬酶2和半胱天冬酶3表达增加。结论：smad4基因对血管平滑肌细胞增殖能力的抑制作用主要通过抑制细胞增殖和诱导细胞凋亡的发生而实现。转化生长因子β信号传导通路对血管平滑肌细胞增殖的抑制作用除了能够有效阻滞细胞周期的演进外，还能够诱导细胞凋亡。