HIV-1B亚型核心蛋白gag基因真核表达载体的构建及其在HepG2细胞中的表达

目的克隆人类免疫缺陷病毒Ⅰ型B亚型核心蛋白gag基因,构建真核表达载体,并在真核细胞中表达,为进一步制备自行设计的以λ噬菌体作为载体的HIV核酸疫苗奠定基础。方法以克隆好的HIV1B亚型U26942全基因质粒DNA作为模板,根据Genbank中gag基因的核苷酸序列设计引物,并在引物的5’端分别引入BamHⅠ及XhoⅠ酶切位点,特异性的扩增gag基因。TA克隆后经双酶切、测序等鉴定重组质粒,再经双酶切、连接构建含gag编码基因的真核表达载体,并进行酶切鉴定分析pcDNA3.1(+)/gag。在脂质体介导下转染HepG2细胞,经G418压力筛选建立稳定转染gag基因的细胞系,用RT PCR及Western印迹检测其在HepG2细胞中的表达。结果重组质粒经BamHⅠ、XhoⅠ双酶切成5.4kb与1.5kb的片断,表明表达载体pcDNA3.1(+)中插入了gag基因片断,测序结果表明编码框正确。RT PCR及Western印迹证实稳定转染gag基因的HepG2细胞系中有该基因的表达。结论成功构建了HIV1B亚型核心蛋白gag基因的真核表达载体pcDNA3.1(+)/gag,并在HepG2细胞中获得稳定表达。     

抗人禽流感病毒H5N1人源化单链抗体噬菌体文库的构建和筛选

目的 利用抗人禽流感病毒H5N1 IgG抗体阳性的人禽流感康复患者外周血淋巴细胞,构建人源化Fv段单链抗体(seFv)噬菌体文库,并筛选与禽流感病毒相关蛋白有结合活性的scFv抗体文库.方法 提取人外周血淋巴细胞总RNA,逆转录成cDNA,以其为模板,利用家族特异性IgG基因的引物,扩增重链和轻链的可变区基因,并用合成的连接子将轻链和重链基因连接成单链抗体片段后,重组到噬菌粒载体pCANTAB5E中.将重组噬菌粒载体电转化大肠杆菌TG1,酶切和PCR鉴定抗体库的重组率,通过测定噬菌体抗体库的滴度计算抗体库的库容,用特异性禽流感病毒相关蛋白筛选表达的单链抗体.结果 构建了源于人禽流感康复患者血清的scFv抗体文库,库容为3.75×104;筛选出与禽流感病毒相关蛋白有结合活性的scFv抗体文库.结论 成功构建了抗人禽流感病毒H5N1的人源scFv噬菌体抗体库,并筛选出特异性结合人禽流感病毒相关蛋白的单链抗体,为进一步制备快速检测试剂和治疗研究提供了基础数据.     

一例基孔肯雅病毒和寨卡病毒混合感染病例的发现

目的 对来自菲律宾的入境旅客（1例发热病例）进行病原体鉴定。方法 采集病例血液样本,提取核酸后进行基孔肯雅病毒和寨卡病毒荧光RT-PCR检测,进而接种Vero细胞分离培养病毒,细胞培养上清用荧光RT-PCR方法和宏基因组序列测定分析法进行病毒鉴定。结果 荧光RT-PCR检测结果显示,该病例存在基孔肯雅病毒和寨卡病毒感染,Ct值分别为20和26;血清样本接种Vero细胞72 h后可观察到明显的细胞病变效应,细胞培养上清的荧光RT-PCR检测和病毒宏基因组测序分析结果显示,Vero细胞中有基孔肯雅病毒和寨卡病毒。结论 该病例为基孔肯雅病毒和寨卡病毒混合感染病例。     

GFP基因真核表达质粒的构建及其在人胚肾293细胞中的表达

目的 克隆绿色荧光蛋白（GFP）基因并构建真核表达载体，观察其在人胚肾293（下称293细胞）细胞中的表达和分布，为制备自行设计的以λ噬菌体为载体的人类免疫缺陷病毒（HIV）核酸疫苗的阳性对照奠定基础。方法 以克隆好的pUC18／GFP为模板，根据Genbank中GFP的核苷酸序列设计引物，并在引物的5′端分别引入BamHⅠ及XhoⅠ酶切位点，特异性扩增GFP基因。TA克隆后经双酶切、测序等鉴定重组质粒，再经双酶切、连接构建含GFP编码基因的真核表达载体，酶切鉴定分析后，将该重组质粒通过脂质体介导，转染293细胞。荧光显微镜观察GFP在细胞内的表达和分布。结果重组质粒经Barn HⅠ、XhoⅠ双酶切成5．4kb与0．7kb的片断，表明表达载体pcDNA3．1（＋）中插入了GFP基因片断，测序结果表明编码框正确，并在293细胞中获得了表达，分布均匀。结论 pcDNA3．1（＋）／GFP真核表达载体已成功构建，并可在293细胞中表达。     

南方五省口岸蚊类携带虫媒病毒调查

[目的]掌握南方口岸蚊媒携带病毒的本底资料,为蚊传疾病的预防控制工作提供依据。[方法]采用电动吸蚊器人工法和捕蚊磁场自动法采集南方5省口岸各类蚊虫。采集到的蚊类超低温送至实验室,研磨处理后用荧光PCR方法检测登革病毒、乙脑病毒、黄热病毒、西尼罗病毒、基孔肯雅病毒等重要蚊媒病毒,结果阳性的标本进一步进行PCR扩增和核苷酸序列测定分析;蚊标本研磨液同时用C6／36细胞进行虫媒病毒分离培养,出现细胞病变后分别用黄病毒科、甲病毒科各自的通用引物进行鉴定;对未能鉴定的未知病毒进一步用随机PCR方法进行扩增、克隆、序列测定、Blast搜索。[结果]从南方5省口岸采集到各类蚊虫12575只,鉴定后共分成254组。各组标本经荧光PCR方法检测,结果登革病毒、黄热病毒、西尼罗病毒、基孔肯雅病毒均为阴性;检测到2份福建省来源三带喙库蚊的标本乙脑病毒核酸阳性,经乙脑病毒E基因引物PCR扩增、测序分析证实为GⅠ型病毒。254份标本经C6／36细胞分离培养出现42份细胞病变,用黄病毒科、甲病毒通用引物PCR扩增,均未得到特异片段。选取1份典型病变的细胞培养物进行随机PCR鉴定,结果发现了1种潜伏于C6／36细胞中的浓核病毒。[结论]南方5省口岸蚊媒中可能未携带登革病毒、黄热病毒、西尼罗病毒、基孔肯雅病毒等重要蚊媒病毒,只有少量蚊虫携带乙脑病毒,蚊虫体内检测到的GⅠ型乙脑病毒属于福建省首次发现,出现病变的C6／36细胞可能是由自身潜伏的1种C6／36细胞浓核病毒引起。     

2例马来西亚籍输入性基孔肯雅热病例的实验室诊断

[目的]通过系统的实验室检测发现并确认2例输入性基孔肯雅病例。[方法]采用实时荧光逆转录（Realtime RT-PCR）、逆转录PCR（RT—PCR）检测方法对病人血清进行检测,并对RT-PGR扩增产物进行核苷酸序列测定。[结果]通过实时荧光RT—PCR、RT—PCR 2种实验方法在该病例标本中检出基孔肯雅病毒核酸;对RT-PCR扩增产物进行测序,测出的521个碱基与基孔肯雅病毒核酸序列比对,结果同源性高达99％。[结论]2病例为输入性基孔肯雅实验室确诊病例。     

玻瓦桑脑炎检测研究进展

玻瓦桑脑炎Powassan Encephlitis PE）是一种由玻瓦桑病毒Powassan Virus POW）引起的以脑组织炎症（脑炎、脑膜炎等）为典型症状的疾病^[1,2]。1958年9月,McLean和Donahue从加拿大安大略省（Antario）玻瓦桑镇一名5岁脑炎患者的大脑神经中枢及脑皮质细胞中首次分离到了该病毒^[1]。从1958—1998年,加拿大和美国东北部共报道了27例人感染玻瓦桑脑炎的病例。     

广东国境口岸不同蚊种COI序列分析和分子鉴定方法

[目的]建立国境口岸不同蚊种的细胞色素C氧化酶亚基I（COI）分子和氨基酸鉴定方法并分析其系统进化关系。[方法]设计1对扩增COI部分编码区的PCR引物，对广州机场、江门和湛江等国境口岸采集的致倦库蚊、三带喙库蚊、白纹伊蚊、中华按蚊、骚扰阿蚊等成蚊和实验室喂养的蚊幼虫进行PCR扩增和序列测定，分析COI核苷酸和氨基酸的系统进化关系。[结果]5种蚊种的COI基因扩增片断长度均为415bp，A＋T含量为68．77％-70．6％。同源性比较表明，不同蚊种间COI片断碱基变异颠换数都明显高于转化数，核苷酸序列及其编码的氨基酸序列同源性分别为85．1％-93．7％和92．0％-99.3％。COI核苷酸系统进化关系显示，所有蚊虫的COI分子鉴定与其形态学结果吻合，但骚扰阿蚊位于一单独的分支上，其亲缘关系与其它蚊种最远。COI基因编码的氨基酸系统进化与蚊虫形态学亲缘关系一致，库蚊属、伊蚊属、阿蚊属聚类为库蚊亚科，中华按蚊与其它蚊种的亲缘关系最远。[结论]建立的COI核苷酸和氨基酸鉴别技术可成功地应用于国境口岸范围内成蚊和幼蚊的属和种的区分，后者更能区分高级分类阶元亚科和正确反映蚊虫的系统发育关系。这可以弥补蚊虫形态特征信息量的不足等传统分类系统的缺点，为广东口岸和其它国境口岸范围内外来的或新发现的蚊种的鉴别提供了分子水平的技术依据。     

诺如病毒快速检测方法的建立及其在国境卫生检疫中的应用

目的:建立快速、特异的诺如病毒实时荧光RT-PCR与常规RT-PCR相结合检测方法,对人感染诺如病毒进行快速检测。方法:根据国外最新流行的诺如病毒核酸序列,设计并合成诺如病毒基因扩增引物及荧光标记探针,摸索最佳反应条件,制定出快速、灵敏检测诺如病毒核酸的实时荧光RT-PCR检测方法及常规RT-PCR检测方法。结果:实验证明,本方法将实时荧光RT-PCR与常规RT-PCR检测方法相结合,能在5 h内快速确认诺如病毒,检测灵敏度达到102拷贝/反应,具有快速、灵敏的特点,且具有较高的特异性和重复性。结论:本实验室利用本方法,首次在广州某国境口岸从外籍发热船员样本中检出5例输入性GGⅡ群诺如病毒。该方法对防止诺如病毒传入我国,保障我国国境卫生安全具有重要意义。     

一起外轮聚集性诺如病毒感染事件的病原学检验

目的报告一起入境外籍船员聚集性非细菌性食物中毒事件的病原学检验。方法采集该外轮11名船员的样本，应用实时荧光RT-PCR方法对样本进行核酸检验，结果呈阳性的样本应用RT—PCR方法进行验证，PCR产物进行测序并做序列分析。结果从11份样本中检出5例诺如病毒GGⅡ-4群阳性。结论引起此次外籍船员腹泻爆发的病原体为GGⅡ-4群诺如病毒。Real—time RT—PCR方法检验诺如病毒快速、准确、特异性强。此次为中国检验检疫机构首次从国境口岸检出诺如病毒。