Poly I:C刺激下原发性干燥综合征患者单核细胞分泌Ⅰ型干扰素能力增强

目的:研究在Poly I:C刺激下原发性干燥综合征(pSS)患者单核细胞分泌Ⅰ型干扰素的能力。方法:分别以50μg/ml和100μg/ml的Poly I:C刺激pSS和健康个体的单核细胞,于刺激后第6和第12小时采用ELISA法检测培养基内IFN-α和IFN-β水平。分别用pSS患者和健康个体的血清培养来自二者的单核细胞,并用50μg/ml的Poly I:C刺激12小时后ELISA法检测培养基内IFN-α和IFN-β水平。结果:Poly I:C能够诱导pSS患者和健康个体的单核细胞呈时间和计量依赖性地释放IFN-α和IFN-β,pSS患者释放IFN-α和IFN-β的能力强于健康个体。pSS血清可以增强Poly I:C诱导单核细胞释放IFN-α和IFN-β的能力。结论:pSS患者单核细胞Poly I:C刺激下分泌Ⅰ型干扰素能力增强,而患者血清可以进一步增强其反应性。天然免疫应答异常可能在pSS发病机制中发挥重要作用。     

原发性干燥综合征患者外周血单个核细胞内肿瘤坏死因子受体相关因子6的表达及意义

[摘要] 目的 研究肿瘤坏死因子受体相关因子6(TRAF6)在原发性干燥综合征(pSS)患者外周血单个核细胞(PBMC)中的表达及其意义。方法 采用实时荧光定量逆转录PCR法检测了23例pSS患者和23例健康对照个体PBMC中TRAF6 mRNA的相对表达量,分析了其与pSS患者血清类风湿因子（RF）、免疫球蛋白浓度、抗SSA抗体和抗SSB抗体的关系。对其中9名pSS患者进行了随访,观察了治疗前后其PBMC中TRAF6 mRNA水平的变化。结果 pSS患者PBMC中TRAF6 mRNA的相对表达量高于健康对照个体(P<0.01),且与血清RF和免疫球蛋白水平呈正相关,但与抗SSA抗体和抗SSB抗体无关。9名患者经过治疗后TRAF6 mRNA表达下调。结论PBMC中的TRAF6参与了SS的发病机制,且是一种潜在的SS标志物。     

CD4+T细胞活化诱导细胞凋亡在原发性胆汁性肝硬化小鼠模型中的作用研究

目的 研究CD4+T细胞活化诱导细胞凋亡(activation induced cell death, AICD)在poly I∶C诱导的原发性胆汁性肝硬化(primary biliary cirrhosis, PBC)小鼠模型中的作用.方法 30只C57BL/6雌性小鼠随机分为模型组和对照组,模型组小鼠腹腔注射poly I∶C 5 mg/kg,对照组小鼠注射等体积无菌PBS,16周后通过测定血清抗线粒体抗体(antimitochondrial antibody, AMA)、碱性磷酸酶(alkali phosphatase, ALP)及肝脏HE染色验证模型.磁珠分离小鼠脾脏CD4+ T细胞,分别以Con A和anti-CD3体外诱导细胞凋亡;实时荧光定量PCR测定T细胞中凋亡相关基因Fas、FasL和TRAIL(tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand)的表达;Western blot检测CD4+ T细胞中抗凋亡基因Bcl-2的表达.结果 poly I∶C注射16周后模型组小鼠血清AMA均为阳性,同时肝组织汇管区出现不同程度的炎性细胞浸润,而对照组AMA均为阴性,肝组织未出现明显病变.模型组小鼠血清ALP[(110.4±18.3) U/L]显著高于对照组[(52.2±15.4) U/L], P<0.001;模型组小鼠脾CD4+ T细胞AICD显著低于对照组(P<0.001),同时定量PCR结果表明:FasL mRNA水平较对照组有所降低(P<0.05),而两组Fas水平差异无统计学意义(P>0.05),TRAIL水平则显著低于对照组(P<0.001);Western blot结果表明模型鼠的抗凋亡蛋白Bcl-2的表达较对照组显著增高.结论 TH1细胞的凋亡缺陷可能在PBC小鼠模型的发病机制中有重要作用,该缺陷可能是由于自身免疫机制引起凋亡相关分子Fas体系及TRAIL的表达变化引起,同时通过上调Bcl-2的表达抑制自身反应性T细胞的凋亡.     

低剂量颗粒溶素对单核细胞和T细胞具有趋化作用

目的探讨低剂量颗粒溶素(GNLY)对免疫细胞的趋化作用。方法抽取健康人全血,分离出外周血单个核细胞(PBMC),经免疫磁珠法纯化出单核细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞、CD4+/CD45RA+T细胞、CD4+/CD45RO+T细胞、CD8+/CD45RA+T细胞和CD8+/CD45RO+T细胞,再用96孔微孔趋化板进行趋化反应。结果颗粒溶素可趋化一些T细胞系、单核细胞系,趋化指数≥2(P<0.05),而对B细胞系的趋化指数为<2。用百日咳毒素预处理过的T细胞系、单核细胞系不再对颗粒溶素有反应,提示颗粒溶素介导的趋化作用涉及G蛋白偶连受体。结论颗粒溶素不仅是一种细胞毒性分子,而且具有化学趋化作用。颗粒溶素在10～100μmol发挥细胞毒活性而在相对较低的浓度下发挥趋化作用且此效应涉及G蛋白偶连受体。     

隐球菌保护性肽表位GMFDGLSGV多聚体的免疫原性研究

目的探讨纯化的隐球菌抗原肽GMFDGLSGV二聚体、四聚体、八聚体重组蛋白激发细胞毒性T淋巴细胞(Cytotoxic T lymphocyte,CTL)免疫应答的能力,为新型隐球菌疫苗的研制打下基础。方法通过细胞增殖和细胞毒性实验,研究纯化的GMFDGLSGV单体、二聚体、四聚体、八聚体重组蛋白刺激外周血单个核细胞(PBMC)产生的增殖反应和细胞毒活性,初步鉴定重组多聚体的免疫原性。结果10例HLA-A*0201阳性个体PBMC对八聚体的平均SI为37.4±3.07;增殖反应明显高于四聚体(平均SI为20.1±1.37)、二聚体(平均SI为14.1±1.06)、单体(平均SI为11.4±0.68)以及阴性对照(平均SI为1±0.10)引起的细胞增殖反应(P<0.01)。在抗原肽诱导的CTL细胞毒活性中,HLA-A*0201阳性个体PBMC对八聚体、四聚体、二聚体、单体及阴性对照组均表现不同程度的杀伤活性,平均活性分别为48.1±4.28、23.9±2.20、16.3±1.27、13.1±1.10、1.0±0.1(P<0.01)。结论本研究得到的重组优化八聚体具有较好的免疫原性,能有效刺激PBMC产生细胞增殖反应和细胞毒活性,为进一步开发有效的隐球菌疫苗打下了基础。     

原发性胆汁性肝硬化患者颗粒溶素的检测及意义

原发性胆汁性肝硬化（PBC）是一种慢性胆汁淤积性自身免疫性肝病，主要特征为肝内中小胆管的非化脓性进行性炎性损伤。颗粒溶素（granulysin，GNLY）是由自然杀伤细胞和激活的细胞毒性T淋巴细胞选择性表达的细胞毒分子。我们采用荧光定量聚合酶链反应（PCR）和酶联免疫吸附法检测PBC患者外周血GNLY的表达，研究GNLY表达在PBC发病机制中的作用，为临床诊治提供依据。     

PolyI:C诱导C57BL/6小鼠产生自身免疫样病变

目的探讨聚肌苷酸胞苷酸(polyinosinic polycytidylic acid,PolyI:C)注射C57BL/6小鼠产生的血清学和组织学自身免疫现象。方法50只6周龄雌性C57BL/6小鼠随机分为药物组和对照组,药物组按5 mg/kg剂量注射PolyI:C,对照组注射无菌PBS,每月每组取5只实验小鼠眼眶采血,间接免疫荧光法测定血清抗核抗体(ANA)和抗线粒体抗体(AMA)。同时取小鼠肝脏做HE染色,显微镜观察病理改变。结果PolyI:C组小鼠血清AMA阳性率逐渐增高,第4月达到80%,此后维持不变,对照组只有1例出现AMA弱阳性。PolyI:C组ANA阳性率在第2月达到100%,对照组随着时间的进行也出现ANA阳性,在第4月达到100%;HE染色发现药物组小鼠肝脏汇管区及部分血管周围均出现不同程度的炎细胞浸润。结论PolyI:C注射C57小鼠可以刺激机体产生自身抗体ANA,AMA,并引起肝脏炎细胞浸润,产生自身免疫样病变,有发生自身免疫性肝病倾向。     

应用聚肌胞苷酸建立原发性胆汁性肝硬化动物模型

目的应用聚肌胞苷酸（polyinosinic polycytidylic acid，poly I：C）建立原发性胆汁性肝硬化（PBC）动物模型。方法80只C57BL／6雌性小鼠，分为空白对照组（5只）、poly I：C5mg／kg组（25只）和10mg／kg组（25只）、阴性对照组（25只）。poly I：C5和10mg／kg组小鼠腹腔分别注射poly I：C5和10mg／kg，每3天1次，阴性对照组用等体积无菌PBS液注射。每4周处死一批小鼠，同时检测血清丙氨酸转氨酶（ALT）、碱性磷酸酶（ALP）、抗核抗体（ANA）、抗线粒体抗体（AMA）水平，肝组织行H-E染色后镜下观察胆管组织学变化；Annexin V检测脾细胞凋亡。结果5mg／kg组第4周小叶间胆管开始出现炎性细胞浸润，浸润的胆管数量随注射时间延长而增加，第20周达51％；血清AMA阳性率逐渐增高，16周达4只（共5只），最高滴度达1：10000。10mg／kg组ANA、AMA均在第8周时明显升高，但随后呈下降趋势，其他指标与5mg／kg组差异无统计学意义（P〉0．05）。5mg／kg组血清ALP显著高于阴性对照组（P〈0．05）。poly I：C两组脾细胞早期凋亡率均明显高于阴性对照组（P〈0．05），但两组间差异无统计学意义（P〉0．05）。阴性对照组仅出现ANA阳性，其他指标均无明显变化。结论poly I：C（5mg／kg）注射16周后可初步建立PBC动物模型。细胞凋亡后释放的自身抗原活化自身反应性淋巴细胞在PBC的发病中可能起重要作用。该模型的建立为今后PBC发病机制和治疗的研究奠定了基础。     

隐球菌性脑膜炎患者颗粒溶素的表达及其临床意义

目的研究颗粒溶素(granulysin,GNLY)免疫效应分子在隐球菌性脑膜炎(cryptococcal meningitis)外周血单个核细胞中的表达及其临床意义。方法首先用密度梯度离心法分离得到25例隐球菌性脑膜炎患者和30例健康人外周血单个核细胞(PBMC),其次用免疫印迹的方法检测其中的GNLY蛋白含量,用实时荧光定量(RFQ)-PCR方法测定其中GNLY的mRNA含量。并分析隐球菌性脑膜炎患者GNLY蛋白含量与一些免疫指标的相关性。结果与健康对照组比较,隐球菌性脑膜炎患者PBMC中GNLY蛋白含量(相对定量为正常对照组的0.56倍)和mRNA(相对定量为正常对照组的0.6倍)均明显降低(P<0.01)。隐球菌性脑膜炎患者中GNLY蛋白表达水平与血清IgG水平成正相关(r=0.477,P<0.05)。结论GNLY可能参与隐球菌性脑膜炎的疾病进程,这为探讨隐球菌性脑膜炎的病情监控和有效治疗提供了新的线索。     

原发性胆汁性肝硬化患者Siglec-1蛋白的表达及其临床意义

目的检测Siglec-1(CD169)在原发性胆汁性肝硬化(PBC)患者外周血单核细胞上的蛋白表达,并探讨其与原发性胆汁性肝硬化发生发展的作用及临床意义。方法流式细胞术检测35例原发性胆汁性肝硬化患者及35例健康对照者、35例肝炎后肝硬化对照者外周血CD14CD169双阳性细胞的表达率;生化常规测定所有入选者血清生化指标水平。结果流式细胞术检测结果显示:原发性胆汁性肝硬化组外周血CD14CD169双阳性率为(13.0±2.2)%,显著高于健康对照组(1.0±0.2)%,及肝炎后肝硬化对照组(4.1±0.4)%,差异具有统计学意义(P<0.01)。并且Siglec-1表达与GGT(r=0.44,P<0.01)和ALP水平(r=0.33,P<0.05)密切相关。结论原发性胆汁性肝硬化患者单核细胞表面siglec-1蛋白表达显著增高,说明原发性胆汁性肝硬化患者外周血单核细胞已经发生巨噬细胞化,单核巨噬细胞介导的免疫炎症反应在原发性胆汁性肝硬化发生发展过程中起重要作用。