Rab蛋白研究进展

Rab蛋白是GTPases的Ras超家族成员之一,与胞内蛋白在各细胞器之间的运输有关。Rab GTPases被命名为小G蛋白,已经发现的Rab蛋白有60多种。Rab蛋白通过胞吐和胞吞的方式在囊泡运输中起重要作用,活性状态下(与GTP结合时),Rab蛋白能通过特定的效应器来介导囊泡运输,本文就Rab蛋白的研究进展做一综述。     

新型纳米载体Ac-αCD携带的Bcl-xl反义寡核苷酸对肺动脉平滑肌细胞增殖和凋亡的作用

目的研究纳米载体Ac-αCD携带的Bcl-xl反义寡核苷酸(antisense oligonucleotide,ASON)对大鼠肺动脉平滑肌细胞(rat pulmonary arterial smooth muscle cells,RPASMCs)增殖和凋亡作用。方法设计合成5’端标记Cy3的Bcl-xlASON,由纳米载体Ac-αCD携带。实验分3组:纳米载体携带的Bcl-xl ASON组(ASON-NPs组)、单纯纳米载体组(NPs组)和空白对照组,分别使用纳米载体Ac-αCD携带的Bcl-xl ASON、纳米载体Ac-αCD和培养液处理RPASMCs 48 h,激光共聚焦显微镜观察RPASMCs对纳米载体携带的Bcl-xl ASON的摄取情况;RT-PCR、Western blot检测Bcl-xl的mRNA和蛋白表达;MTT检测处理后细胞的增殖抑制率;流式细胞仪检测细胞凋亡率。结果激光共聚焦显微镜下可见ASON-NPs组细胞质内大量呈颗粒状均匀分布的红色荧光物质,空白对照组和NPs组细胞细胞质内未见红色荧光物质;ASON-NPs组处理的RPASMCs的Bcl-xl mRNA和蛋白表达显著低于空白对照组和NPs组(P<0.05);ASODN-NPs组、NPs组、空白对照组细胞抑制率分别为:(53.61±3.02)%、(6.30±1.90)%、(1.40±0.62)%,凋亡率分别为:(53.04±2.09)%、(10.98±2.03)%、(2.19±0.11)%、ASON-NPs组和NPs组细胞抑制率、凋亡率均显著高于空白对照组(P<0.01),ASON-NPs组均显著高于NPs组(P<0.01)。结论纳米载体Ac-αCD携带的Bcl-xl反义寡核苷酸能被RPASMCs有效摄取,从而抑制其增殖,促进凋亡。     

一氧化碳对血管平滑肌的作用

一氧化碳（ＣＯ）是一种新型信使分子。细胞色素Ｐ－４５０还原酶作用于血红素，使其降解还原为胆绿素时可内源性产生ＣＯ。血管平滑肌细胞（ＶＳＭＣ）也可产生内源性ＣＯ。ＣＯ可以舒张血管，抑制血小板聚集，调节内皮的功能，进而通过负反馈作用于ＶＳＭＣ。     

β-AR激活对脂多糖导致的肺微血管内皮屏障功能障碍的保护作用

目的研究β-AR在脂多糖导致的肺微血管内皮屏障功能障碍中的调控作用。方法 LPS(10μg/ml)处理细胞2～8 h;分别激活β1-AR和β2-AR后再利用LPS处理6 h。采用Transwell小室法检测内皮屏障通透性,共聚焦显微镜观察细胞肌动蛋白(F-actin)的形态,蛋白质免疫印迹试验(Western Blot)检测细胞连接蛋白VE-cadherin和occludin的表达;质粒转染方法转染β2-AR-GFP,免疫荧光技术标记Rab5a,共聚焦显微镜观察Rab5a和β2-AR-GFP在细胞内的定位。结果 LPS对肺微血管内皮屏障通透性的作用呈时间依赖性,随时间延长通透性增加,在6～8 h达到最高峰;LPS导致骨架蛋白F-actin形态学发生改变、应力纤维形成,下调VE-cadherin和occludin的蛋白表达水平;选择性激活β2-AR可部分逆转LPS对内皮屏障的损伤作用;Rab5a与β2-AR-GFP共定位于细胞膜,受体激活后主要共定位于细胞核周。结论β2-AR在肺微血管内皮细胞的激活可调控细胞骨架蛋白重构以及细胞间连接蛋白表达水平,对LPS导致的内皮屏障损伤有一定的保护作用。     

大鼠Occludin基因克隆及其在肺泡Ⅱ型上皮细胞中的表达

目的 克隆大鼠紧密连接蛋白Occludin基因,构建哺乳动物表达载体.为进一步研究该基因的功能提供手段.方法 采用RT-PCR法克隆大鼠Occludin基编码序列,定向克隆法构建该基因哺乳动物表达载体.脂质体介导该栽体转染人肺泡Ⅱ型上皮A549细胞,Western-blot法检测Oecludin蛋白表达.结成功克隆Occludin基因,构建pCMV-Occ哺乳动物表达载体并在A549细胞中表达.结论 pCMV-Occ载体可介导Occludin基因在人肺Ⅱ型上皮A549细胞表达.     

缺氧对大鼠主动脉平滑肌细胞增殖的反应

目的 探讨缺氧对大鼠地动脉平滑肌细胞增殖的效应。方法 应用免疫组织化学染色、＾３Ｈ－ＴｄＲ掺入、流式细胞仪检测技术探讨缺氧对大鼠主动脉平滑肌细胞（ＡＳＭＣ）增殖的影响。结果 缺氧１２ｈ其增殖细胞核抗原（ＰＣＮＡ）阳性反应颗粒增加,２４ｈ明显增加,其含量是常氧组２．１倍。低氧８ｈ可使ＡＳＭＣ的＾３Ｈ－ＴｄＲ摄取量减少（Ｐ〈０．０５）,１２ｈ则促进其摄取,２４ｈ则明显较常氧对照组增多（Ｐ〈０．０５）。     

基因芯片筛选Sirt1在小鼠急性呼吸窘迫综合征炎症损伤中相互作用的基因

目的筛选小鼠急性呼吸窘迫综合征炎症损伤中与Sirt1相互作用的基因,探讨Sirt1在急性呼吸窘迫综合征炎症反应中的作用机制。方法购买Sirt1过表达(Tg)小鼠和野生型(WT)小鼠,饲养、繁殖、鉴定新生小鼠基因型;Western Blot鉴定小鼠肺组织Sirt1表达差异;建立ARDS小鼠模型,观察ARDS小鼠肺组织HE染色病理变化,并采用ELISA检测两种ARDS小鼠肺组织IL-6表达差异;采用基因芯片筛选Sirt1在小鼠ARDS炎症损伤中相互作用的基因。结果通过聚合酶链反应鉴定出Tg和WT两种不同基因型的小鼠;免疫印迹法检测小鼠肺组织Sirt1的表达差异结果提示Tg小鼠肺组织Sirt1含量显著高于WT小鼠(P=0.001);不同浓度LPS腹腔注射12 h后小鼠肺组织HE染色病理变化提示随着LPS用量增加,两种小鼠肺组织损伤程度明显增加,且WT-ARDS小鼠的肺组织损伤程度比Tg-ARDS小鼠更为严重;当LPS用量达到20 mg/kg时两组小鼠存活率50%;两种小鼠腹腔注射LPS(15 mg/kg)后,肺组织IL-6的表达随时间推移逐渐呈现逐渐增高的趋势,在3,6,12,24 h WT-ARDS组肺组织IL-6表达浓度显著高于Tg-ARDS组(P0.05),尤其在12 h差异最为显著(P=0.007)。基因芯片筛选出在小鼠ARDS炎症损伤中与Sirt1相互作用的基因有Ubd,Ube2d2b,Olfm4,Il1rl1,Hivep3和Lpar1。结论 Sirt1可能通过调控Ubd,Ube2d2b,Olfm4,Il1rl1,Hivep3和Lpar1的表达减轻ARDS小鼠的炎症损伤。     

肺动脉平滑肌细胞对低氧诱导的肺微血管内皮细胞白介素表达的调节及机制

目的 研究低氧对肺微血管内皮细胞(PMVECs)的白细胞介素(IL)6、IL-1β、受体酪氨酸激酶(RTK)和Janus激酶3(JAK3)表达的影响,以及肺动脉平滑肌细胞(PASMCs)在其中的调控作用.方法 单独培养的大鼠PMVECs分为正常(N)组及低氧2h(H2)组、6h(H6)组、12h(H12)组,另设立PMVECs共培养组(与PASMCs共同培养)和单纯培养组,均接受6h或12h的低氧(氧浓度为3%)处理.应用RT-PCR方法 检测IL-6、JAK3的mRNA表达水平,放免法测定培养细胞上清中的IL-6蛋白含量,放射性酶分析法测定细胞膜、胞质中RTK的活性,ELISA法测定细胞培养上清中的IL-1β蛋白含量.结果 低氧刺激后,PMVECs的LL-6、JAK3 mRNA表达及IL-6、IL-1β蛋白含量均增加.与N组比较,低氧处理各组的以上各指标均有所上升(P<0.01),以6h时间点最为明显(P<0.01).胞膜RTK活性在低氧刺激各组明显降低(P<0.01),而胞质RTK活性明显升高(P<0.01),以12h时间点最为明显(P<0.05).在低氧刺激6h后,共培养组的PMVECs内IL-6、JAK3的mRNA表达,以及IL-6、IL-1β蛋白含量均较单纯培养组有所降低(P<0.05);在低氧刺激12h后,共培养组的PMVECs的RTK活性也较单纯培养组降低(P<0.05).结论 低氧可以促进PM-VECs的IL-6 mRNA表达.并能增加IL-6和IL-1β蛋白含量,复合培养情况下PASMCs对此具有下调作用,其机制可能与RTK和JAK涉及的信号转导通路有关.