抗HBsAg单链抗体在大肠杆菌中的表达及活性测定

应用重叠ＰＣＲ自人源性ＨＢｓＡｇ抗体Ｆａｂ片段中扩增出ＶＨ、ＶＬ 基因 ,以 (Ｇｌｙ4 Ｓｅｒ3)ｌｉｎｋｅｒ连接成单链抗体 ,插入表达载体ｐＱＥ 4 0 ,在大肠杆菌内获得包涵体表达。工程菌表达优化试验表明 ,在Ａ60 0 为 0 .6时开始诱导 ,持续 6ｈ ,目的蛋白表达量最高 ,达菌体总蛋白 34 .2 %。包涵体变性后以金属镍螯合柱一步纯化 ,目的峰透析复性 ,得到纯度为 97%的具有结合ＨＢｓＡｇ活性的重组单链抗体。抗HBsAg单链抗体在大肠杆菌中的表达及活性测定@任向荣!510602$广州解放军第四五八医院全军传染病中心 @熊盛$华南理工大学…     

抗HBsAg单链抗体与白细胞介素-2融合蛋白的构建与序列测定

目的:构建以人抗乙肝表面抗原（HBsAg）单链抗体（ScFv）为导向作用,白细胞介素-2（IL-2）为治疗作用的融合蛋白原核表达载体pQE 40/ScFv-IL-2。方法:应用PCR技术将抗HBsAg单链抗体与白细胞介素-2在分子水平上进行基因重组,构建中间载体pGEM7Zf（+）/ScFv-IL-2,经酶切鉴定及序列测定正确后,将目的基因片段克隆到pQE 40表达载体中,转化大肠杆菌,经IPTG诱导表达。结果:SDS-PAGE结果显示在相对分子质量约4.3×104Da处,可见蛋白表达带。以鼠抗人IL-2单克隆抗体经免疫印迹验证,该表达蛋白为所设计的融合蛋白。结论:融合蛋白ScFv-IL-2的成功构建及表达,为融合蛋白的纯化和研究开发新型的乙肝导向治疗的基因工程药物打下良好的基础。     

HCV感染进展至肝细胞癌的长间期

有关乙型肝炎病毒(HBV)与肝细胞癌(HCC)的关系已有很多报道,而丙型肝炎病毒(HCV)感染在HCC发病机理中也有一定的影响。本文分析了西方HCC病人抗-HCV的情况以及发病前有输血史的病人从输血至进展为肝硬变和HCC的间期,旨在探讨HCV感染与肝硬变和HCC之间的关系,以及疾病进展的急缓状况。 研究对象为1988～1993年期间诊断为肝硬变和HCC的191例病人。HCC诊断依据:(1)超声、CT可疑;(2)组织学检查;(3)血清AFP>500ng/ml。肝硬变的诊断依据组织学检查。     

重组人源抗HBsAg单链抗体的纯化及亲和常数测定

目的:对融合6×His标签的人源抗乙型肝炎表面抗原单链抗体的包涵体进行纯化和复性, 并对复性产物的抗原结合性质进行鉴定。方法:工程菌表达的包涵体裂解后, 金属螯合亲合层析纯化, 然后以尿素透析、盐酸胍透析和金属螯合亲和层析柱原位复性3种方法进行复性;复性产物以免疫亲和层析精制, 非竞争酶免疫法测定亲和常数结果:盐酸胍透析复性产物的比活性最高, 蛋白回收率为(61.08±1.45)%;精制后的重组单链抗体的亲和常数为(2.30±0.32)×10⁷L/mol.结论:本株单链抗体可以应用优化的透析复性技术, 在体外高效复性, 其抗原结合性质不受N末端纯化标签的影响。     

高复制HBV转基因小鼠模型对抗乙型肝炎病毒药物的效应研究

 目的：研究高复制HBV转基因小鼠模型对抗乙肝病毒药物的效应评价。 方法： 选用抗乙肝药物拉咪呋啶、大剂量重组乙肝蛋白疫苗、α-1b型干扰素和RNA干扰在转基因小鼠进行药效及作用机制评价。 结果：拉咪呋啶、重组乙肝疫苗、α-1b型干扰素均可使HBV转基因小鼠血清中HBV DNA滴度显著降低。其中后两者还可提高机体脾细胞IL-2和IFN-γ的水平及使分泌IFN-γ脾细胞Elispot斑点数明显增加。将RNA干扰表达载体pU6-siHBV质粒尾静脉注入小鼠体内。注射后5 d血清HBsAg下降56.7%,抑制作用持续14 d。肝脏免疫组化显示HBcAg阳性细胞明显减少，但血清HBV DNA定量无明显降低。 结论： 本近交系高复制HBV转基因小鼠模型对抗乙肝药物药效学评估是可靠、可行的。     

人源性乙型肝炎表面抗体Fab段的表达及纯化的研究

通过噬菌体显示技术 ,获得人源性抗 ＨＢｓＦａｂ片段基因 ,重组至大肠杆菌中分泌表达该抗体的可溶Ｆａｂ片段 ,并对此Ｆａｂ片段进行纯化和研究。构建成噬菌体显示文库 ,经ＨＢｓＡｇ特异性淘筛获得Ｆａｂ片段基因。在大肠杆菌中进行分泌表达 ,经ＦＰＬＣ纯化 ,用ＳＤＳ ＰＡＧＥ及蛋白印迹法分析、鉴定 ,并用固相放射免疫法检测其活性单位。再用表达的前Ｓ ,前Ｓ1,前Ｓ2蛋白检测其结合的抗原位点。结果获得了抗体Ｆａｂ段的基因及表达该片段的工程菌。经ＦＰＬＣ纯化的抗体Ｆａｂ片段呈单一峰 ,与抗 ＨＢｓ阳性血清相似。纯化后的抗体Ｆａ…     

shRNA表达质粒对转基因小鼠HBV的抑制作用

目的观察shRNA表达质粒对转基因小鼠HBV的抑制作用。方法将质粒DNA采用Hydrodynamic技术注入HBV转基因小鼠体内,观察血清ALT和AST水平、血清HBsAg和肝组织HBcAg表达和HBVmRNA的变化。结果在注射质粒后,ALT和AST呈一过性升高,3天后降至正常;血清HBsAg和肝细胞内HBcAg表达减少,蛋白抑制至少持续14天;质粒注射后第5天,实验组肝脏HBVmRNA与注射前相比明显减少,而对照组HBVmRNA信号无明显变化。结论shRNA表达质粒对HBV转基因小鼠HBV有抑制作用。     

刀豆素A诱导小鼠腹腔巨噬细胞内吞与细胞内游离钙的关系

采用电镜和粘附式细胞仪（ＡＣＡＳ５７０）观察了胶体金标记的刀豆素Ａ（ＣｏｎＡ－Ａｕ）与小鼠腹腔巨噬细胞（Ｍφ）表面ＣｏｎＡ受体的结合、内吞及其在Ｍφ中转运的形态学改变，同时分析ＣｏｎＡ刺激后Ｍφ内游离钙（Ｃａ２＋）的变化。ＣｏｎＡ孵育１ｍｉｎ后，配体进入内吞小泡，第２次内吞约需２０ｍｉｎ。粘附式细胞仪分析表明：ＣｏｎＡ刺激后５０ｓ，Ｃａ２＋急剧上升，平均住值达０．５５７Ｕ；约１００ｓ后，恢复到刺激前水平；１８ｍｉｎ后，Ｃａ２＋重新回升，持续约１８ｍｉｎ后开始下降。本实验揭示配体再内吞与Ｃａ２＋重新上升的时间相吻合，其肯定性和机理有待于进一步研究证实。     

HBV基因在第20代HBV转基因小鼠中的复制和表达

目的研究HBV基因在已传20代BALB／c-TgN（HBV D型1．3）SWS458小鼠中复制和表达情况。方法采用PCR荧光定量检测法、ELISA检测和免疫组化的方法研究HBV基因在转基因小鼠体内的复制和表达情况。结果F20代BALB／c-TgN（HBVD型1．3）SWB458小鼠血清HBVDNA为（104—106）copy／mL，HBsAg表达量为（124．41±33．46）ng/mL，preS1和HBcAg的OD值分别为0．248±0．076和0．635±0．338。肝组织有HBsAg和HBcAg表达，且HBsAg为胞浆型，HBcAg为核型。结论经过筛选和培育，本转基因小鼠传至20代时HBV基因复制表达稳定，表明我们已经获得一个传代表达稳定的HBV转基因小鼠品系。     

抗HBsAg单链抗体特异性单克隆抗体的制备及应用

目的获得抗HBsAg单链抗体(HBScFv)的单克隆抗体,并初步研究其在抗HBsAg类小分子抗体及其融合蛋白质的纯化、活性鉴定方面的应用。方法利用杂交瘤技术,以大肠杆菌表达的重组抗HBScFv为抗原,免疫Balb/c小鼠,再将小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0进行细胞融合。通过ELISA法、Western-blot鉴定特异性单克隆抗体,通过免疫双扩散法鉴定单抗亚型,并将筛选到的高效价单抗用于抗HBsAg Fab抗体等重组蛋白质的亲和色谱及ELISA鉴定。结果建立了9株能够稳定分泌抗HBScFv特异性单克隆抗体的细胞株,其细胞上清效价为1∶160~1∶12 800,腹水效价为1∶50 000~1∶400 000;单克隆抗体的亚类分析结果显示有6株为IgG1,其余3株为IgG2a。初步应用结果表明制备的单克隆抗体14F7可用于抗HBsAg Fab抗体等重组蛋白质的亲和色谱及活性鉴定。结论成功建立了能够稳定分泌HBScFv特异性单克隆抗体的细胞株。