北戴河滨海湿地根际石油降解菌的筛选及功能分析

以北戴河碱蓬-芦苇滨海湿地采集的5个根际土壤样品为研究材料,使用以原油为唯一碳源的选择培养基富集培养石油降解菌,采用重量法评价降解效率,通过GC-MS分析研究高效降解菌的降解特性,利用排油圈法测定降解菌的表面活性剂产生能力。研究结果表明,初筛获得22株石油降解菌,在25℃降解21d的条件下对石油的降解率为17%～38%,其中qhd2B降解率最高,为38%,其中8株具有较好的产表面活性剂的能力。16s测序结果经BLAST比对,所分离获得的22株菌中,8株菌属于放线菌门(Actinobacteria),13株菌属于变形菌门(Proteobacteria),有一株拟杆菌门(Bacteroidetes)丽水菌属(Yeosuana)。选取石油降解率在31%以上菌株进行GC-MS分析,结果显示其对大部分烷烃和多环芳香烃都有较好的降解效果。其中菌株qhd2B对烷烃和芳烃的总降解率分别为79.9%和76.7%,是一株优良的石油降解菌。     

海洋石油降解菌群的固定化及石油降解特性

为克服岸滩溢油生物修复过程中海浪冲刷等不利环境对石油降解菌(群)岸滩定植的影响,本文利用聚乙烯醇(PVA)和海藻酸钠作为载体对石油降解菌群DC10进行固定化,通过研究细菌固定化微球的机械性能、传质性能及石油降解特性等参数,确定石油降解菌群的最优固定化条件。实验结果表明:6%PVA,2%海藻酸钠及0.5%活性炭制备的凝胶可以通过蠕动泵方便快捷制备细菌固定化微球,其粘度小、易成型、机械强度高。海洋石油降解分析表明,与游离菌体(FB)相比,固定化菌群12d石油降解率提高了近7%;GC-MS分析显示,石油烷烃和芳烃降解效果显著。实验证明,石油降解菌群DC10经过固定化处理,其石油降解活性提高,连续降解能力增强,该研究为溢油岸滩的生物修复提供新的技术方法。     

胶州湾沉积物中石油降解菌的降解能力及多样性研究

2013年青岛输油管道爆炸，大量石油污染了附近海岸。课题组采集了污染的沉积物样品，以原油为唯一碳源和能源，富集了四个石油降解菌群。生物多样性和群落分析表明，Luteibacter、Parvibaculum 和属于食烷菌科的一个属是降解菌群的主要优势菌，都属于变形菌门。从石油降解菌群中分离筛选，获得了9株具有不同16S rRNA基因序列的降解菌，分别属于8个属。重量法测定降解菌的石油降解率，其中5株的石油降解率大于30%。GC-MS分析结果表明，石油降解菌多倾向于降解烷烃，对多环芳烃的降解能力较差，其中5株细菌的烷烃降解率较大，仅1株菌D2对多环芳烃的降解率较大，其降解率在34.9%到77.5%。通过对高通量数据的分析，表明食烷菌属是菌群A和菌群E的主要降解菌群，其中筛选获得的菌株E4可能是菌群E的一株优势降解菌。本研究所筛选菌株证明了其石油降解潜力，为油污染海滩生物修复提供了菌株资源。     

海洋烷烃降解菌Alcanivorax sp.A-11-3的分离鉴定及其降解酶基因研究

从马六岬海峡的表层海水中分离到一株石油降解菌A-11-3.经16S rDNA Blast结果表明其与Alcanivorax borkumensis SK2具有最高相似性为96%,该菌可能是食烷菌属的一个新种.该菌具有很强的石油降解能力.结果表明,A-11-3对烷烃的降解范围较宽,能以C8～C36的烷烃为唯一碳源和能源生长;在7d内该菌对柴油的降解率达到49.5%.此外,还从菌株中克隆到了大小为426bp的烷烃羟化酶基因alkB片段和843bp的P450 烷烃羟化酶基因的部分序列.序列分析表明,alkB片段编码的氨基酸序列与A. borkumensis SK2T的AlkB1和AlkB2的同源性分别为57.75%和40.14%;该菌的P450与SK2菌株的P450具有最高同源性,为87%.研究结果对于海洋石油降解微生物生态研究及石油污染生物修复技术开发有参考价值.     

海洋石油降解菌的筛选鉴定及其功能基因研究

以石油原油为唯一碳源,从中国海洋大学海洋微生物菌种库15株菌中筛选到5株石油降解菌。16SrRNA基因测序结果表明,WH072、WH069、WH303、ZXM008和ZXM183分别为耐盐芽孢杆菌(Bacillus halodurans)、除烃海杆状菌(Marinobacter hydrocarbonoclasticus)、弯曲芽孢杆菌(B.flexus)、普里兹湾假交替单胞菌(Pseudoalteromonas prydzensis)和嗜麦芽糖寡养单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)。其中对石油降解率最高的为WH072(高达36.4%),其次是WH069(20.0%)。对这5株菌检测已报道的石油烃降解酶基因,结果在WH072和WH069中均检测到了alkB、P450和almA3种功能基因。根据功能基因编码的氨基酸序列构建系统发育树并分析其各自的进化关系,发现P450基因在一定程度上具有种属特异性。对本研究首次报道的高效石油降解菌耐盐芽孢杆菌WH072,采用高效热不对称性交错PCR(hiTAIL-PCR)方法,成功获得了这3种功能基因的全长序列,其中alkB与已知同源基因序列相似性较低,其结构和功能有待进一步研究。     

南极石油烃降解嗜冷菌的筛选及其降解特性的研究

从385株南极海洋细菌中筛选出2株石油烃降解菌NJ276和NJ341,并对其降解特性进行了初步研究。以柴油为唯一碳源进行降解实验的结果表明,它们在5℃时20 d内对柴油的降解率分别达到23.47%和32.15%,在15℃时20 d内降解率分别达到43.95%和62.47%,其降解能力随着培养温度的升高而显著增强;石油烃降解残油组分的GC-MS分析结果表明,柴油经过嗜冷菌NJ276降解后的残油组分中能检测到C15～C21七种烷烃,经过嗜冷菌NJ341降解后的残油组分只能检测到少量C16,C17和C18三种烷烃。对它们进行16S rDNA基因序列的同源性和系统发育分析结果表明,菌株NJ276属于假交替单胞菌属(Pseudoaltero monas),菌株NJ341属于科尔韦尔氏属(Colwellia)。     

不同碳源富集的石油烃降解菌群结构的分析

以原油和正十六烷为唯一碳源,从长期受石油污染的环境中富集和分离具有不同功能的石油烃降解菌,并利用平板法和PCR-DGGE法时不同碳源富集到的菌群结构进行分析.结果表明,利用2216E平板从以原油和正十六烷为碳源的富集液中各得到两株菌,分另11为TJ-1、TJ-2和TJL-1和TJL-2,分子生物学方法鉴定结果表明,这4株菌分别为短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、威尼斯不动杆菌(Acinetobacter venetianus)、Oceanobacillus picturaeP和短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus).PCR-DGGE分析结果表明,以原油和正十六烷为碳源的富集液中优势菌分别有5种和2种,且2种富集液中的优势菌明显不同.对比PCR-DGGE和平板法分析结果,可以看出PCR-DGGE法能够提供更全面的菌群结构信息.     

秦山核电站邻近水域石油降解细菌的生态学研究

本文分析了1989年4月(春),7月(夏),10月(秋)和1990年1月(冬)秦山邻近水域表层水中石油降解细菌的丰度和分布规律,同时比较了温度、含油量、营养盐、溶解氧、盐度等环境因素对其数量变动的影响。分析结果发现,测区表层水中石油降解菌数量最高值达1.1×10~5个/dm~3,最低值为400个/dm~3,季节变化波动于97～4.9×10~4个/dm~3之间,菌量变化与水温,含油量呈正相关,与盐度呈负相关趋势,认为测区高营养盐、高溶解氧状况可能不成为石油降解细菌生长繁殖的限制因子,并指出测区低丰度的石油降解菌数量与该海区低水平的油污是一致的。     

海洋石油降解微生物的分离鉴定

以柴油为惟一碳源,从胜利油田黄河码头和厦门储油码头两个海水样品中富集得到两组柴油降解菌,共9株细菌,1株真菌,它们对柴油都有降解能力.16SrDNA鉴定结果表明这9株细菌中有3株摩加夫芽孢杆菌、1株施氏假单胞菌、1株腊样芽孢杆菌、1株反硝化产碱杆菌.1株阿氏葡萄球菌、1株食烷菌和1株类似很小海旋菌的未知新菌(M-5),其中B-5对柴油的降解能力最强,已报道的食烷菌属中其他种的同源性最高,为95.2%,表明它是该属中的一个新种.实验中获得的惟一一株真菌M-3属于假丝酵母,对柴油有较强的降解和乳化能力.实验中还从B5和施氏假单胞菌M-2中扩增到了烷烃降解的限速酶烷烃单加氧酶的基因片断,其中B5编码了一种新的烷烃单加氧酶.这些菌在石油污染的海水自净中起着重要作用,可用于海洋石油污染的生物修复.     

南极石油烃降解嗜冷菌的筛选及其降解特性的研究

从385株南极海洋细菌中筛选出2株石油烃降解菌，并对其降解特性进行了初步研究。以柴油为唯一碳源进行降解实验的结果表明，南极嗜冷菌NJ276和NJ341在5℃、20d内对柴油的降解率分别达到23．47％和32．15％，在15℃、20d内降解率分别达到43．95％和62．47％，其降解能力随着培养温度的升高而显著增强；石油烃降解残油组分的GC～MS分析表明，柴油经过NJ276降解后的残油组分中能检测到C15～C21七种烷烃，柴油经过NJ341降解后的残油组分只能检测到少量C16,C17和C18三种烷烃。对它们进行16S rDNA基因序列的同源性和系统发育分析表明，菌株NJ276属于假交替单胞菌属（Pseudoalteromonas），NJ341属于科尔韦尔氏属（Colwellia）。     

南极菌Pseudoalteromonas sp.S-15-13引导糖基转移酶基因表达对环境因子变化的响应

为了探讨胞外多糖在南极微生物低温适应性中的作用与机制,克隆了南极菌Pseudoalteromonas sp.S-15-13的引导糖基转移酶(GTF)核心片段,并采用Real-Time PCR的方法研究了温度、冻融循环、盐浓度、pH等条件对该糖基转移酶基因(gtf)表达的影响。结果表明,低温有利于gtf的表达,短时的低温刺激(2℃)1 h后,gtf的表达量即上调为对照的1.5倍;而该菌经4和10℃培养24 h后gtf的表达量约为20℃时的8~12倍;经过冻融循环gtf的表达量上调,在第2个冻融循环后gtf 的表达量较对照提高了3.667倍;盐浓度对gtf的影响表现为低促高抑,即NaCl含量为6.0 %时gtf 的表达量是对照(3.0%)的3.59倍,当NaCl含量达9.0 %时gtf 表达量则显著下调;在一定范围内(pH5.0~8.0),pH的改变会促进gtf 的表达,当pH为6.0时gtf 表达量约为pH7.0时的2倍。该结果为探讨胞外多糖在南极微生物环境适应性中的作用与机制提供了科学依据。     

钝顶螺旋藻藻胆蛋白的提取及其特性初报

作者采用细胞破碎,等电点沉淀的方法,提取、分离螺旋藻的藻胆蛋白,并在藻胆蛋白中检测到17种氨基酸。文中还研究了在500～700nm波长范围内不同外界因子对藻胆蛋白理化特性的影响,结果表明:(1)不同的pH值,藻胆蛋白液颜色及其吸收光谱的形状和强度不同。当pH为4和5.5时,藻胆蛋白液呈绿蓝色,吸收峰在625nm处,而pH为7,吸收峰移至600nm处,溶液呈蓝色,pH为8.5和10时,出现双峰,分别位于600nm和650nm处。(2)藻胆蛋白热稳定性差,吸收光谱强度随着温度升高而迅速下降。温度在30℃以下,藻胆蛋白较稳定。(3)藻胆蛋白对光照较敏感。(4)10％乙醇、10％蔗糖、1％NaCl对藻胆蛋白均有不同程度的增色效应。     

温度和pH对刺参(Apostichopus japonicus)消化酶活力的影响

消化酶活力能够反映刺参对不同营养成分的消化能力。当某一反应条件发生改变时,消化酶的活力大小就会发生变化,因此研究不同因子对消化酶活力的影响对于了解消化酶的性质具有重要的意义。温度和pH是影响消化酶活力的最重要的反应条件。本文中作者应用酶学分析研究了温度和pH对剌参前肠和中肠各种消化酶活力的影响。蛋白酶活力测定采用福林-酚法,脂肪酶活力测定采用水解法,淀粉酶活力和纤维素酶活力测定采用水杨酸显色法。实验结果表明,反应温度和反应pH对刺参前肠和中肠中的消化酶活力具有显著影响(P<0.05)。前肠和中肠中蛋白酶活力均在反应温度为50℃时达到最大值,前肠和中肠中脂肪酶和纤维素酶均在反应温度为40℃时达到最大值,而前肠和中肠中淀粉酶最适反应温度分别为40℃和30℃。刺参前肠蛋白酶活力在酸性环境下较中肠高,且在反应pH为5.0—5.8之间酶活力相对稳定,而中肠蛋白酶活力在碱性环境下较前肠高,且在反应pH为7.0—8.6之间酶活力相对稳定;刺参前肠脂肪酶活力随着pH的升高出现两个相对稳定的峰值,分别为4.2—5.0和6.2—7.0区间,中肠脂肪酶活力在pH为3.8时达到最大值,而在pH超过9.0明显失活:剌参前肠和中肠淀粉酶活力在pH变化时表现出相似的变化趋势,在反应pH为6.6—7.4之间酶活力较高且相对稳定;剌参前肠和中肠中纤维素酶活力在pH变化时反应不一致,前肠淀粉酶在反应pH为6.2—7.4之间酶活力较高且相对稳定,中肠纤维素酶活力在反应pH为5.4—7.0之间酶活力较高且相对稳定。此外,通过比较四种消化酶比活力值的大小,可以看出剌参蛋白酶活力最高,其次为纤维素酶和淀粉酶活力,而脂肪酶活力最低。     

抑制尖刀镰孢菌(Fusarium oxysporum)南极细菌的筛选及Psychrobacter sp.P4-11-07-1的生长特性

以植物病原真菌尖刀镰孢菌(Fusarium oxysporum)为指示菌,采用平板扩散法从实验室极地微生物资源库中筛选到12株具有明显抑菌作用的活性菌株。分子鉴定与系统发育分析表明,7株活性菌株属于假交替单胞菌(Pseudoalteromonas)、3株属于嗜冷杆菌(Psychrobacter)、1株属于假单胞菌(Pseudomonas)、1株属于伦黑墨氏菌(Rheinheimera)。抑菌谱测定结果表明,不同活性菌株的抑菌谱也有所不同,12株活性菌株对尖刀镰孢菌、辣椒疫霉(Phytophthora copsici)、大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)、瓜亡革菌(Thanatephorus cucumeris)均有一定的抑制作用,而对葡枝根霉(Rhizopus stolonifer)均没有抑制作用;除菌株1-Z11,1-Z18,4-Z11,4-Z18,IS-010-07-1,P3-11-10-1,Z18-3外,其余5株菌株均对水稻纹枯病菌(Rhizoctonia solani)有抑制作用。对一株具有较强抑菌活性的菌株Psychrobacter sp.P4-11-07-1生长条件的研究表明,当培养温度为5～30℃,培养基盐度为0～45,初始pH值为5.0～11.0时,菌株P4-11-07-1均可生长并产生抑菌活性物质,对应抑菌活性最高的培养条件分别是:培养温度为25℃,培养基盐度为0,初始pH为7.0。     

固定化海藻吸附金属离子的影响因素

研究了固定化海带吸附含铜、镉溶液过程的影响因素,结果表明,在pH为3.0~5.0时对Cu2+保持高的吸附率,在pH为4.0时对Cd2+的吸附率达到最大.随着Cu2+,Cd2+金属离子初始浓度的降低,吸附率有所降低.对Cd2+的吸附率均随着温度的升高而变大.随着吸附剂浓度的增大,对Cu2+,Cd2+的吸附率逐渐升高,与此相反,对Cu2+,Cd2+的吸附量则逐渐减小.粒径对Cu2+的吸附率影响较小,对Cd2+的吸附率有较明显的变化.     

Enzymatic properties of UFE, a novel marine fibrinolytic enzyme

A novel potent protease, Urechis unicinctus fibrinolytic enzyme (UFE), was firstly discovered. The enzymatic properties of UFE were further investigated. As a low molecular mass protein, UFE appeared to be very stable to heat and pH. When temperature was below 50 ℃, the remnant enzyme activity remained almost unchanged, but when temperature was raised to 60 ℃, the remnant enzyme activity began to decrease rapidly. UFE was quite stable in the range of pH value from 3 to 12, especially in slightly alkaline pH value. Mn2 , Cu2 and Fe2 ions were activators of UFE, while Fe3 and Ag ions were inhibitors of UFE. Fe2 ion along with Fe3 ion might regulate UFE activity in vivo. The optimum pH and temperature of UFE were about 8 and 50 ℃, respectively. Other characteristics of this enzyme were also studied. Systematic research results are significant when UFE is applied for medical and industrial purposes.     

Key genes expression of reductive tricarboxylic acid cycle from deep-sea hydrothermal chemolithoautotrophic Caminibacter profundus in response to salinity, pH and O2

CO2 fixation pathway of Caminibacter profundus, a chemolithoautotrophic -Proteobacteria from deep-sea hydrothermal vent, was determined and characterized by genetic and enzymatic analyses. Gene expression of key enzymes for CO2 fixation in response to salinity, pH and O2 in Medium 829 were also investigated. The results demonstrate that C. profundus contained aclB, porA and oorA, the genes encoding key enzymes of reductive tricarboxylic acid (rTCA) cycle. However, genes fragments of cbbL and cbbM encoding key enzyme of Calvin cycle were not recovered. Key enzymatic activities of ATP citrate lyase (ACL), pyruvate: ferredoxin oxidoreductase (POR) and 2-oxoglutarate: ferredoxin oxidoreductase (OOR) were also present in C. profundus. The combination of genetic and enzymatic analyses confirm that C. profundus adopted rTCA cycle for carbon assimilation. The results of aclB and oorA relative expressions of C. profundus demonstrate that the ranges of environmental factors for high genes expression were sea salt 3.0%-5.0% (optimum 3.0%), pH 5.0-6.5(optimum pH 6.5), anaerobic to microaerobic conditions (optimum 1.0% O2 ). Gene expression patterns under different conditions show similar patterns with bacterial growth, revealing that key rTCA cycle genes provided molecular basis for bacterial growth and propagation. Our results suggest that C. profundus could regulate key genes of rTCA cycle for carbon assimilation and energy metabolism in response to environmental fluctuations in hydrothermal vent.     

南极菌Pseudoalteromonas sp. A211-5产α-淀粉酶Amy3809的表达、性质及其降解特性

对具有高淀粉酶活性的南极菌Pseudoalteromonas sp. A211-5的全基因组数据进行了分析和筛选,筛选获得α-淀粉酶疑似序列amy3809,并采用基因工程手段对该基因的功能和性质进行验证和分析。首先,以淀粉酶Amy3809的完整开放阅读框(ORF)为模板设计特异引物,克隆获得amy3809的全序列并对其进行重组表达,获得的重组蛋白采用镍柱进行分离纯化;DNS-还原糖法测定重组酶的酶学性质;薄层层析(TLC)技术对Amy3809的酶解产物进行分析。实验结果:1)克隆获得的amy3809成功地连接到pET-30a载体,并在工程菌E.coli BL21(DE3)中实现了高效表达,纯化的重组酶Amy3809分子量为67 kDa;2)重组酶Amy3809在10~40℃的范围内仍能保持85%以上的酶活,但随着温度的升高酶活迅速降低,70℃时几乎失活,表明该酶具有良好的低温耐受特性及热敏感性;3)最适pH为7.0,在pH 5.0~10.0的范围内仍能保持50%以上的活性;4)金属离子Na+,K+和Ca2+均能提高Amy3809的活性,而Cu2+,Fe2+,Mg2+和EDTA则能显著降低Amy3809的活性;5)Amy3809的酶解产物主要为麦芽四糖、麦芽三糖、麦芽糖和葡萄糖。由此可知,南极菌产的α-淀粉酶Amy3809,具有良好的低温耐受特性,热敏感性和较广的pH耐受范围,并能够有效地将淀粉降解为低聚糖和葡萄糖,因而具有潜在的工业应用前景。     

木瓜蛋白酶降解甲壳胺的研究

采用一种木瓜蛋白酶过甲壳胺进行降解。研究了酶用量、pH值、温度、时间四个因素对反应的影响。其中,温度的影响作用显著,时间具有较小的影响作用(pH:3.0～6.0;温度:30°～60℃;时间:2～8h)。实验结果表明降解反应不遵循简单的动力模式。在pH4.0、40°C、8h、1.5mg/mL木瓜蛋白酶的条件下,分子量为(5～10)×105时用甲壳胺可容易地被木瓜蛋白酶降解为高度解聚的甲壳胺。     

光助Fenton氧化法去除水中两种氯乙酸及其动力学研究

以二氯乙酸和三氯乙酸为目标污染物,研究了光助Fenton氧化去除水中卤乙酸的可行性及影响因素,并对其动力学进行了初步研究.结果表明,影响光助Fenton氧化的因素很多,氙灯功率500 W、H2O2和Fe2+投加量分别为5.0和1.0 mmol·L-1、pH=4.0反应60 min是所考察范围内的最佳降解条件,浓度为100 μg·L-1的二氯乙酸和三氯乙酸的降解率分别为90.32％、87.77％;在实际水质pH=7.0时,相同浓度的二氯乙酸和三氯乙酸的降解率分别为75.34％、68.80％.紫外辐射与Fenton氧化对二氯乙酸和三氯乙酸的降解具有协同效应.光助Fenton氧化对二氯乙酸和三氯乙酸的降解符合一级反应动力学,表观活化能分别为30.11、31.09 kJ·mo1-1,受温度影响不大.