人神经干细胞移植到缺氧缺血性脑损伤新生大鼠脑内的存活及分布★

目的：新生儿缺氧缺血性脑病是导致脑性瘫痪的重要原因，至今缺乏有效疗法。将体外培养的人神经干细胞经脑室移植入缺氧缺血性脑损伤新生鼠，观察植入细胞在宿主脑内的存活、迁移及分化。 方法：实验于2005-01/09在解放军海军总医院儿科实验室完成。①对象：神经干细胞来源于孕12周流产的人胎儿脑组织，孕妇签署知情同意书，符合医院伦理委员会规定。清洁级SD新生鼠80只，随机数字表法分为细胞移植组、模型对照组，40只/组，实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准。②实验方法：取人胚胎脑组织，机械分散法分离单个核细胞，接种于添加表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、白血病抑制因子的N2培养基中，获取生长旺盛的人神经干细胞球，制成单细胞悬液，浓度约为5.0×1011 L-1，培养6 d后行PKH标记用于植入后示踪。两组新生鼠均建立缺氧缺血性脑损伤模型，造模后3 d，细胞移植组损伤侧脑室缓慢注入5 μL人神经干细胞悬液，模型对照组于相同部位注入等量生理盐水。③实验评估：取未经PKH标记的细胞球， 通过免疫细胞化学染色鉴定巢蛋白的表达及其向神经元、星形胶质细胞的分化情况。分别于细胞移植后1，2，4周及3个月，常规取脑组织，行免疫组织化学和荧光分析，观察植入后细胞存活及分布情况。 结果：在造模及细胞移植过程中，因麻醉、出血细胞移植组新生鼠死亡5只，模型对照组死亡7只，存活率85%~90%。①神经干细胞的鉴定及分化：80％活细胞巢蛋白呈阳性表达，并可分化为神经元、星形胶质细胞。②神经干细胞植入后存活及分布情况：植入后1周，神经丝蛋白阳性细胞多位于损伤侧皮质及海马处，纹状体、脑干、小脑、嗅球也有少量分布。植入后2周，海马和皮质可见神经丝蛋白阳性细胞，胞体伸出的神经微丝更长，细胞数量与1周时基本相似。植入后4周及3个月时PKH阳性细胞数量明显减少。 结论：在含有表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、白血病抑制因子的N2培养基中形成的人神经干细胞球，具有良好的增殖能力，可分化为神经元，移植至缺血缺氧新生鼠脑中能够向损伤区迁移，分布范围广。     

神经干细胞移植治疗缺氧缺血性脑损伤的实验研究

目的 研究神经干细胞移植治疗缺氧缺血性脑损伤的可行性。方法 取孕龄为12－16天的母鼠，从胎脑中分离神经细胞，进行培养、鉴定。用出生7天的SD大鼠的新生鼠制作缺氧缺血性脑损伤的动物模型，7天后接受神经干细胞移植（移植组，n＝16只），同时设置对照组，只注射磷酸缓冲液（对照组，n=8只），8－10周后，作Y迷宫实验检测大鼠的学习能力和记忆能力。取脑组织作免疫组织化学检查。结果 从大鼠胎脑中成功培养出神经干细胞，培养条件下呈悬浮状态生长，形成神经球，绝大多数的细胞表达神经干细胞的标志物神经巢蛋白（nestin）。接爱神经干细胞移植组大鼠的学习能力、记忆能力和对照组相比，有明显提高，差异具有显著性（P＜0.05）。接受神经干细胞移植大鼠组织中可见存活的移植细胞，并和宿主脑组织融合在一起。结论 在体外培养条件下，可从胎脑组织中培养出神经干细胞，移植到缺氧缺血性脑损伤大鼠脑内后，细胞与宿主的脑组织融合在一起，动物的学习、记忆能力有改善。移植神经干细胞是治疗缺氧缺知性脑损伤的有效方法之一。     

新生大鼠缺氧缺血性脑损伤后骨髓基质细胞移植时间的选择☆

目的：众多研究已证实骨髓基质细胞移植治疗缺氧缺血性脑损伤是有效的，但移植时间点的选择尚无定论。在新生大鼠缺氧缺血性脑损伤后不同时间点进行骨髓基质细胞移植，通过对其远期行为学及组织学检测，探讨最佳的移植时间窗。 方法：实验于2005-06/2006-06在中南大学湘雅医院中心实验室完成。①动物：选取清洁级7 d龄SD大鼠50只，随机数字表法分为5组：正常对照组、模型对照组、24 h，72 h，7 d细胞移植组，10只/组。另取4周龄SD大鼠10只用于骨髓基质细胞的培养。实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准。②实验方法：除正常对照组外，其余组大鼠均建立缺氧缺血性脑损伤模型。在脑立体定位仪下，24 h，72 h，7 d细胞移植组分别于造模后对应时间点，将体外培养3~5代且经Hochest33324标记24 h的鼠骨髓基质细胞2 μL脑内移植于左侧海马，约105个细胞。③实验评估：各组大鼠40 d日龄时进行迷宫觅水测试，记录觅水时间、错误次数、重复次数。行为学测试后取脑组织片行尼氏染色，计数左侧海马CA1区神经元数。在荧光显微镜下观察骨髓基质细胞的存活、增殖，用免疫组化法检测骨髓基质细胞神经元特异性烯醇化酶的阳性率。 结果：50只大鼠均进入结果分析。①放射臂迷宫实验检测：模型对照组觅水时间、错误次数、重复次数均高于正常对照组和各细胞移植组（P < 0.01），24 h细胞移植组上述3项指标均低于72 h，7 d细胞移植组（P < 0.05）。②左侧海马CA1区神经元尼氏染色结果：模型对照组神经元数较正常对照组明显减少（P < 0.01），且排列紊乱，丢失明显；24 h，72 h，7 d细胞移植组神经元数均较模型对照组显著增加（P < 0.01），排列整齐；24 h细胞移植组神经元数较72 h，7 d细胞移植组明显增多（P < 0.05）。③骨髓基质细胞体内增殖和神经分化情况：骨髓基质细胞移植后30~40 d仍可在移植部位及左侧皮质区存活、增殖。24 h细胞移植组左脑神经元特异性烯醇化酶阳性表达率显著高于72 h，7 d细胞移植组（P < 0.01）。 结论：新生大鼠缺氧缺血性脑损伤后24 h接受骨髓基质细胞移植可最大程度改善脑损伤所导致的远期行为学障碍，其机制可能与早期移植可有效减轻神经元的坏死、凋亡，且有利于骨髓基质细胞的迁移、分化有关。     

促红细胞生成素干预缺氧缺血性脑损伤新生鼠神经干细胞巢蛋白的表达☆

背景: 巢蛋白是一种存在于神经干细胞的特异性抗原,在神经系统发生病变或损伤引起再生时广泛表达,因此巢蛋白表达常用作判定神经系统发生病变或损伤后能否促进神经再生的一种手段。 目的：从神经再生和神经干细胞激活的角度,探讨外源性促红细胞生成素对新生鼠缺氧缺血性脑损伤后神经干细胞巢蛋白表达的影响。 方法：结扎大鼠右侧颈总动脉和8%低氧暴露2 h制备新生大鼠缺氧缺血性脑损伤模型。对照组仅游离右侧颈总动脉,不予结扎和缺氧处理。干预组大鼠缺氧缺血后立即腹腔注射重组人促红细胞生成素5 000 IU/kg,1次/d,连用3 d。缺氧缺血性脑损伤组大鼠缺氧缺血后连续腹腔注射等量生理盐水溶液3 d。每组随机取8只分别于术后4,7,14 d处死。应用免疫组化方法和计算机图像分析技术检测不同时点海马齿状回巢蛋白标记阳性细胞的变化。 结果与结论：各时点缺氧缺血性脑损伤组巢蛋白阳性细胞数较对照组增加(P < 0.05);各时点干预组巢蛋白阳性细胞较对照组和缺氧缺血性脑损伤组均增加(P < 0.05)。3组大鼠海马齿状回区巢蛋白阳性细胞数均于术后 7 d 达高峰。结果提示早期给予重组人促红细胞生成素可促使新生鼠缺氧缺血性脑损伤后海马齿状回区巢蛋白表达增加,促进神经干细胞的增殖再生,在缺氧缺血性脑损伤后神经再生、修复中发挥一定的保护作用。     

立体定向移植神经干细胞治疗局灶性大鼠脑缺血损伤的研究

目的观察大鼠胚胎神经干细胞移植到局灶性脑缺血大鼠脑室内的迁移和分化。方法实验于2003年5月~2004年10月在哈尔滨医科大学附属二院动物实验中心完成。孕龄8~10d Wistar大鼠仔鼠神经干细胞体外扩增后用免疫组织化学的方法分别检测神经干细胞及其分化后代的特异性标志蛋白-巢蛋白、胶质纤维酸性蛋白和神经元特异性烯醇化酶的表达,健康Wistar大鼠大脑中动脉闭塞后40只随机分成A、B、C、D四组,A组为梗塞后24小时脑室内移植神经干细胞组,B组为梗塞后24小时梗塞中心移植神经干细胞组,C组为梗塞后4周脑室内移植神经干细胞组,D组为梗塞后4周梗塞中心移植神经干细胞组,各实验组均有仅移植生理盐水的空白对照。比较神经干细胞不同移植部位和不同移植时间神经干细胞存活、增殖和迁移的差异。结果实验大鼠40只均进入结果分析。从胎鼠中成功培养出悬浮生长的可表达巢蛋白的神经球,含血清条件下可分化为表达胶质纤维酸性蛋白的胶质细胞和神经元特异性烯醇化酶的神经元,移植后可见移植细胞存活至少8周以上,A组可见移植细胞大量存活,穿过室管膜向脑组织迁移,特别是向缺血周边区迁移;B组细胞主要聚集在梗塞中心移植区域,也有大量细胞存活,充填梗塞区,少量细胞可穿过胼胝体向健侧迁移;C组仅见少量Brdu阳性细胞存活,但细胞增殖分裂较A组不明显,且存活细胞主要仍在移植部位;D组存活移植细胞也较B组明显减少。结论大鼠胚胎神经干细胞移植到局灶性脑缺血大鼠脑室内可长期存活并广泛迁移,不同移植部位不影响细胞存活,脑室内移植细胞向脑缺血区域迁移,缺血后24小时移植较缺血后4周移植其迁移趋向性更强。     

神经干细胞移植对脑出血模型大鼠神经功能的影响☆

背景：外源性神经干细胞具有神经修复作用，可能对脑出血后的神经功能恢复起到一定的作用。 目的：观察胎鼠神经干细胞的体外生长、分化及移植到脑出血大鼠后的存活、迁徙、分化情况，探讨神经干细胞对脑出血模型大鼠受损神经功能的修复作用。 设计：完全随机分组设计，对照动物实验。 单位：复旦大学附属华山医院神经外科 材料：选用健康雄性成年SD大鼠18只为受体，体质量280~320 g，由中国科学院上海实验动物中心提供。实验用鼠抗BrdU为Neomarkers产品, 鼠抗胶质纤维酸性蛋白和兔抗微管相关蛋白2 为Chemicon产品。 方法：实验于2006-02/12在复旦大学附属上海医学院解剖组胚实验室完成。从胎龄14 d的胎鼠海马中分离、培养、鉴定神经干细胞。16只受体SD大鼠被随机分为3组：对照组，PBS组和移植神经干细胞组。均通过尾状核内注射自体动脉血制作大鼠脑出血模型。移植NSC组在造模后30 min在血肿腔周围四点分别移植浓度为2×1011 L-1神经干细胞悬液5μL；PBS组于相同时间点在脑内相同部位注射PBS；PBS和神经干细胞的移植方法同自体血的移植方法。对照组大鼠在造模后30 min只造成四点损伤，不注射任何物质。 主要观察指标：在造模后立即，1，3，5，14，21，28 d采用前肢评分和转身评分对大鼠神经功能进行评估。大鼠于造模后28 d麻醉后取脑，并通过双标胶质纤维酸性蛋白、微管相关蛋白2、BrdU免疫组化来检测移植入脑的神经干细胞在体内的分化情况。 结果：①神经功能评分：造模后5 d，各组差异无显著性意义（P > 0.05）。造模后14~28 d，干细胞移植组较其他3组明显改善（P < 0.05）。②脑组织切片双免疫组织学双标染色结果：干细胞移植组血肿周围凋亡细胞少于PBS组。受体大鼠脑组织切片显示有BrdU, 微管相关蛋白2,胶质纤维酸性蛋白阳性细胞，说明神经干细胞可以在宿主脑内存活、迁徙和分化，可以分化为神经元样细胞和神经胶质样细胞。 结论：神经干细胞移植可能通过分化为神经元样细胞和神经胶质细胞促进大鼠脑出血的神经功能恢复。     

人脐血单个核细胞移植在缺氧缺血性脑损伤新生大鼠脑内的迁移及分化

背景：研究发现脐血单个核细胞脑内移植后可以存活，并减轻缺氧缺血性脑损伤程度，显著改善脑损伤大鼠的远期行为学，但作用机制仍未阐明。 目的：将人脐血单个核细胞经侧脑室移植入缺氧缺血性脑损伤新生大鼠脑内，观察植入细胞在脑内的迁移与分化。 设计、时间及地点：细胞学体内观察，于2007-12/2008-08在潍坊医学院分子影像学研究中心完成。 材料：脐血来源于健康、足月妊娠产妇，由潍坊医学院附属医院产科提供。清洁级健康7 d龄SD新生大鼠50只，由山东省中医药大学动物中心提供。 方法：Ficoll法体外分离培养人脐血单个核细胞，移植前3 d行BrdU标记。50只大鼠均采用Rice-Vannucci法复制缺氧缺血性脑损伤模型，造模后24 h，在左侧侧脑室(AP：-0.5 mm，ML：-2 mm，DV：-2 mm)注入脐血单个核细胞悬液，2 μL/点，共1×105个活细胞。分别于细胞移植后24 h，3 d，7 d，14 d，28 d取材制备脑组织切片，10只/时间点。 主要观察指标：采用免疫荧光双标法检测移植脐血单个核细胞的脑内迁移、神经干细胞的表达、分化情况。 结果：50只大鼠均进入结果分析。①移植后24 h侧脑室内可见BrdU+细胞；移植后3，7 d移植细胞迁移到室管膜下区；移植后14，28 d移植细胞迁移到大脑皮质及海马。②移植后24 h侧脑室内可见BrdU+nestin+细胞；移植后3 d室管膜下区出现BrdU+nestin+细胞；移植后7 d BrdU+nestin+细胞数增加；移植后14 d BrdU+nestin+细胞数下降。③移植后14 d大脑皮质、海马开始出现BrdU+NSE+细胞与BrdU+GFAP+细胞，移植后28 d双阳性细胞数进一步增加，BrdU+NSE+ 细胞及BrdU+ GFAP+细胞占BrdU+的比例也增加。 结论：脐血单个核细胞侧脑室移植入脑内后可以继续存活，并迁移到大脑皮质与海马部位，分化为成熟的神经元与神经胶质细胞。     

人胎脑神经干细胞在年幼大鼠脑内的成神经元分化★

目的：脑组织中不同部位的的神经元因功能不同具有特定的细胞形态，移植的神经干细胞能不能在相应部位分化成其相应的神经元还不明确。实验拟观察人胎脑神经干细胞植入年幼大鼠脑后的成神经元分化的作用，探讨神经干细胞替代治疗小儿脑病的可行性。 方法：实验于2007-04/07在海军总医院细胞实验室内完成。①实验材料：16周孕龄的人胎脑组织由海军医院妇产科提供，实验经孕妇及家属知情同意，并经医院伦理委员会批准。14只出生后10 d的同窝年幼SD大鼠，雌雄不分，由北京大学医学部实验动物中心提供，为二级清洁动物，实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准。②实验方法：自孕16周的人胎脑组织分离培养神经干细胞球，在脑脊液中培养诱导分化实验以证明其分化潜能。将培养14 d的神经干细胞球移植于10 d龄大鼠侧脑室内，于移植后第4，7，14天行人神经丝特异性标志的免疫荧光分析，显示神经元的分布和细胞形态。 结果：①培养获得典型神经干细胞球，呈漂浮生长，在小儿脑脊液中能分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。②采用抗人神经丝混合单抗检测移植物的成神经元分化，移植后第4天，观察到阳性反应细胞在颗粒层表现为颗粒性细胞，锥体细胞层则出现长突起的锥体细胞，还有连接神经元样中间神经元，小脑内有单层排列的浦肯野细胞。对比各时间点的观察结果，阳性细胞分布位置未变，随着移植后天数的后延，阳性细胞数量呈减少趋势，但锥体细胞的突起明显加长。 结论：体外培养获得的人神经干细胞经脑室途径移植于年幼大鼠，在脑内发生迁移，并分化成形态上与其所在位置的宿主细胞一致的神经元。提示宿主脑组织微环境在引导移植物分化成神经元中发挥了重要作用，该结果对细胞替代治疗小儿脑病有重要启示意义。     

黄芩苷协同人脐血间充质干细胞静脉移植治疗幼鼠缺氧缺血性脑损伤☆

背景：最近研究证实黄芩苷对多种脑损伤具有广泛的神经系统保护作用。 目的：探讨中药单体黄芩苷干预并协同人脐血间充质干细胞静脉移植治疗幼鼠缺氧缺血性脑损伤的可行性。 设计、时间及地点：随机对照动物实验,于2007-02/2008-01在南昌大学第一附属医院神经内科实验室完成。 材料：健康孕妇足月顺产儿的脐带血10份,取自南昌大学一附院产科。清洁级7 d龄SD新生鼠85只,随机分为正常对照组15只、模型组20只、细胞移植组25只、细胞移植+黄芩苷组25只。 方法：采用明胶沉降+密度梯度离心法分离人脐血单个核细胞,体外扩增至第5代用于移植,使用前6~12 h行DAPI标记。模型组、细胞移植组、细胞移植+黄芩苷组新生鼠建立缺氧缺血性脑损伤模型,空白对照组不作任何处理。分别于造模后2,3,4,5周,细胞移植组、细胞移植+黄芩苷组经尾静脉注射DAPI标记好的人脐血间充质干细胞悬液5~10 μL/g,细胞浓度为1×109 L-1。从细胞移植第1天起,细胞移植+黄芩苷组动物经腹腔注射120 mg/kg黄芩苷,1次/d,连续3 d。 主要观察指标：脑组织病变情况,脑组织DAPI阳性细胞数,脐血间充质干细胞移植后定位情况。 结果：移植后4周,细胞移植+黄芩苷组脑组织病变率明显低于模型组、细胞移植组(P < 0.05)。与细胞移植组比较,第1,2,4周细胞移植+黄芩苷组DAPI阳性细胞数均显著增加(P < 0.01)。造模后第3周开始细胞移植的病灶脑组织,在黄芩苷的协同作用下可见大量DAPI阳性细胞集中分布于病灶区周围,与宿主脑整合,没有明显的界限,而对侧非缺血区很少见到DAPI阳性的脐血间充质干细胞分布;造模后第4,5周开始细胞移植的病灶脑组织,其DAPI阳性细胞明显减少。 结论：选择缺氧缺血性脑损伤后第3周进行细胞移植效果较佳,黄芩苷能够协同人脐血间充质干细胞有效地透过血脑屏障,在病灶脑组织周围迁移、扩散、整合。     

神经干细胞移植联合脑源性神经营养因子局部注射对老年性痴呆鼠海马线粒体膜电位及行为学的影响

背景：移植神经干细胞的分化受移植部位微环境、各种生长及细胞因子的影响。 目的：实验拟观察神经干细胞移植与脑源性神经营养因子联合应用对老年性痴呆鼠行为学恢复及海马线粒体膜的影响。 设计、时间及地点：随机对照动物实验，于 2006-09/2007-09在重庆医科大学动物实验室及细胞实验室完成。 材料：神经干细胞来源于新生1 d龄SD大鼠。Y迷宫筛选对电击敏感并逃避迅速的三四月龄健康雄性SD大鼠，随机分成4组：正常对照组、神经干细胞组、脑源性神经营养因子组、联合组移植，每组10只。 方法：分离培养大鼠神经干细胞。参照包新民等的大鼠脑立体定位图谱制备老年性痴呆大鼠模型。造模后，神经干细胞组双侧海马区注射神经干细胞, 脑源性神经营养因子组双侧海马区注射脑源性神经营养因子，联合移植组注射神经干细胞同时持续侧脑室注射脑源性神经营养因子。 主要观察指标：用分子生物学检测老年性痴呆大鼠海马线粒体膜电位的变化，行Y迷宫试验观察大鼠行为学中学习记忆能力。 结果：联合移植组老年性痴呆大鼠海马线粒体膜电位明显升高, 并高于神经干细胞组、脑源性神经营养因子（P < 0.05）, 与正常对照组比较无明显差异。脑源性神经营养因子组、神经干细胞组学习记忆能力虽有明显恢复，但与联合移植组和正常对照组比较还有一定的距离（P < 0.05）。 结论：神经干细胞与脑源性神经营养因子联合应用能能稳定海马线粒体功能，从而抑制神经细胞凋亡，能改善老年性痴呆鼠的学习记忆功能障碍。