富血小板血浆诱导犬骨髓间充质干细胞的体外成骨*

背景：富血小板血浆中含有大量骨再生所需的生长因子,且各生长因子的比例是机体自身形成的,具有良好的协同作用。 目的：探讨富血小板血浆体外诱导犬骨髓间充质干细胞成骨的效果。 设计、时间及地点：细胞学体外观察,于2007-06/2008-02在中南大学湘雅医院中心实验室完成。 材料：健康12月龄雄性比格犬,由中南大学湘雅医学院实验动物部提供。 方法：收集第3代犬骨髓间充质干细胞,分为4组：对照组加入标准培养基;成骨诱导培养基组向培养板孔内加入含胎牛血清、地塞米松、β-甘油磷酸钠、维生素C的高糖DMEM培养基;富血小板血浆组根据预实验结果,向培养板内加入含体积分数为6.25%富血小板血浆的低糖DMEM培养基;联合组向培养板内加入含地塞米松、β-甘油磷酸钠、维生素C、体积分数为6.25%富血小板血浆的高糖DMEM培养基。 主要观察指标：细胞内碱性磷酸酶活性,免疫细胞化学染色检测Ⅰ型胶原的表达,改进Von Kossa染色标记钙结节形成情况,RT-PCR检测诱导后骨钙素mRNA的表达。 结果：各组碱性磷酸酶活性均随诱导时间的延长而逐渐增高,联合组升高幅度最为明显(P < 0.05)。诱导7,14 d后,成骨诱导培养基组、联合组Ⅰ型胶原均呈阳性表达,富血小板血浆组、对照组Ⅰ型胶原始终呈阴性表达。诱导14 d后,成骨诱导培养基组、联合组可见卵圆形钙结节。诱导7,14 d后,对照组与富血小板血浆组之间骨钙素mRNA表达水平无明显差异(P > 0.05),此2组骨钙素mRNA表达水平均明显低于成骨诱导培养基组、联合组(P < 0.05);成骨诱导培养基组骨钙素mRNA表达水平明显低于联合组(P < 0.05)。 结论：经成骨条件培养基诱导培养的骨髓基质干细胞,富血小板血浆能在体外显著诱导其成骨指标的表达。     

富血小板血浆对体外培养骨骼肌干细胞增殖及成骨活性的作用☆

背景：已有研究发现富血小板血浆可以影响骨髓间充质干细胞和脂肪干细胞的生长和分化。 目的: 观察富血小板血浆对体外培养的骨骼肌干细胞增殖与诱导成骨的影响,探讨富血小板血浆影响骨骼肌干细胞的机制。 设计、时间及地点：随机对照动物实验,于2008-06/10在上海交通大学附属第六人民医院中心实验室完成。 材料：普通级新西兰大白兔9只,体质量2.5~3 kg,年龄1岁左右,雌雄不限。 方法：取兔右后肢比目鱼肌体外培养新西兰大白兔骨骼肌干细胞。取兔耳中央动脉血,经离心处理后制备富血小板血浆。将细胞分为实验组与对照组,实验组以含12.5%自体富血小板血浆的条件培养液干预,对照组不进行富血小板血浆干预。 主要观察指标：①细胞形态学观察。②以四甲基偶氮唑盐法检测细胞增殖活性。③以碱性磷酸酶钙钴法染色、碱性磷酸酶活性测定、茜素红染色和骨钙素免疫荧光染色检测细胞成骨活性。 结果：四甲基偶氮唑盐法显示富血小板血浆诱导实验组较对照组增殖明显(P < 0.01);碱性磷酸酶活性较对照组增高明显(P < 0.01)。富血小板血浆诱导实验组碱性磷酸酶染色阳性,骨钙素免疫荧光染色阳性,茜素红染色可见钙结节形成。 结论: 富血小板血浆对体外培养的骨骼肌干细胞增殖与成骨分化活性具有显著的促进作用。     

不同血清培养条件下骨髓间充质干细胞的增殖

背景：目前,分离培养骨髓间充质干细胞应用最为广泛的细胞生长添加剂是胎牛血清/小牛血清,应用脐血清进行骨髓间充质干细胞培养的相关研究较少。 目的：观察不同血清培养对骨髓间充质干细胞增殖的影响。 方法：用Ficoll密度梯度离心法分离纯化骨髓间充质干细胞,在含脐血清、胎牛血清以及无血清的L-DMEM培养基中培养,观察各组细胞形态、增殖情况;应用流式细胞术对细胞表面抗原CD34、CD44、CD45、CD105进行表型鉴定。 结果与结论：脐血清培养后细胞形态较小,似纺锤状,细胞呈网状生长;胎牛血清培养后细胞呈梭形成纤维细胞样,呈集落样生长;脐血清和胎牛血清均能促进细胞生长增殖,但骨髓间充质干细胞在脐血清中增殖更活跃,无血清培养基本无增殖。流式细胞鉴定显示CD34、CD45阴性,CD44、CD105阳性,脐血清扩增后骨髓间充质干细胞的表面标记无明显改变。     

不同血清微环境对大鼠骨髓间充质干细胞体外培养的影响**☆

背景：骨髓间充质干细胞在培养过程中,常在基础培养基中添加一定的血清,最常见的是小牛血清和胎牛血清,但这存在着一定的生物安全性隐患。 目的：观察不同血清微环境对大鼠骨髓间充质干细胞体外培养的影响。 方法：自成年大鼠骨髓中分离骨髓间充质干细胞,采用全骨髓贴壁法培养。分别以下列血清微环境培养：自身血清组：分离细胞后原代用含大鼠自身血清的培养基培养,传代后换用含胎牛血清的培养基培养;同种异体血清组：分离细胞后原代用含同种异体血清的培养基培养,以后用胎牛血清培养基培养;胎牛血清组：分离后用含胎牛血清培养基培养,以后一直用含胎牛血清培养基培养;DMEM组：分离细胞后原代用不含血清的DMEM培养基培养,传代后换用含胎牛血清的培养基培养。在倒置相差显微镜下观察细胞的形态;细胞的贴比率;生长曲线;流式细胞仪观测细胞表面CD11b、CD45和CD90表达。 结果与结论：大鼠自身血清微环境及同种异体血清微环境细胞形态均一性、在融合度均高于其他组;首次传代天数低于其他组。24,48,72 h贴比率自身血清组、同种异体血清组和胎牛血清组均高于DMEM组(P < 0.01)。在细胞生长曲线中大鼠自身血清组倍增速率最快,其次为同种异体血清组,再者为胎牛血清组,而DMEM组细胞未见明显倍增现象。流式细胞仪检测含血清培养基培养条件下各组第3代细胞CD11b和CD45阳性细胞率均达到98%以上,CD90阳性率小于2%,可以得到纯度较高的骨髓间充质干细胞。但是在无血清微环境条件下,CD11b的阳性率为95.83%、CD90阳性率达2.07%,而CD45阳性率仅为64.79%,可见无血清环境下培养的骨髓间充质干细胞纯度明显低于含血清微环境。提示大鼠自身血清微环境下更有利于骨髓间充质干细胞的贴壁、生长及纯化。     

电针诱导人骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化

背景：目前经报道的成骨诱导方法很多,为骨髓间充质干细胞的成骨诱导提出很多新的思路及方法。但是电针是否能诱导骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化尚不清楚。 目的：尝试应用电针治疗仪诱导人骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化,评价其作为骨组织工程种子细胞的可行性。 方法：从患者髂后上棘抽取骨髓,分离培养鉴定为骨髓间充质干细胞后,取第3代细胞进行培养。当细胞铺满培养瓶底90%以上时进行胰酶消化,分别以3.0×103/cm2的浓度接种于6孔培养板中。实验随机分为3组：空白对照组：加入2 mL体积分数为10%胎牛血清的L-DMEM/F12培养液;化学诱导组：每孔内加2 mL含10%胎牛血清的L-DMEM培养液,当细胞贴壁生长达到60%~70%汇合时,加入骨诱导剂;电针刺激组：加入2 mL体积分数为10%胎牛血清的L-DMEM/F12培养液,电针刺激,采取连续波输出,基波脉冲频率为50 Hz,基波脉冲宽度0.5 ms,持续作用30 min,共电针刺激28 d。相差倒置显微镜观察细胞形态变化;茜素红染色结果;细胞诱导14,28 d后碱性磷酸酶活性;RT-PCR测定细胞中骨钙素mRNA的表达;Western Blot测定细胞中骨钙素蛋白表达。 结果与结论：①在28 d的诱导过程中,化学诱导组5~7 d细胞汇合成单层,细胞突起互相连接,并可重叠生长而不发生细胞间的接触抑制现象;电针刺激组9 d或10 d发现细胞体积大,呈三角形、多角形或鳞形;空白对照组细胞形态仍然是纺锤状。②化学诱导组和电针刺激组28 d在倒置相差显微镜下均观察到有矿化结节出现,进行茜素红均呈阳性反应,而空白对照组呈阴性反应。③骨髓间充质干细胞在体外进行诱导时化学诱导组和电针刺激组碱性磷酸酶水平在14,28 d高于空白对照组(P < 0.05);且化学诱导组碱性磷酸酶14 d时高于电针刺激组(P < 0.05),但28 d时差异无显著性意义(P > 0.05)。④空白对照组骨钙素mRNA及蛋白含量均低于化学诱导组和电针刺激组(P < 0.05)。提示电针可定向诱导人骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化。     

富血小板血浆体外培养骨髓间充质干细胞的增殖与胶原产生

间充质干细胞是可大量获取的肌腱组织工程种子细胞,但体外如何诱导其分化为功能化腱样细胞成为此项技术的关键。 目的：观察富血小板血浆对体外培养骨髓间充质干细胞分裂增殖和胶原产生的影响。 方法：分离培养兔骨髓间充质干细胞,并采用自体富血小板血浆对骨髓间充质干细胞进行干预(设立高、中、低剂量富血小板血浆组,并设空白对照组),每日计数细胞并绘制细胞生长曲线,用MTT比色法分析各组骨髓间充质干细胞的存活和增殖能力。以ELISA定量检测细胞的胶原产生,通过RT-PCR反应测定富血小板血浆干预前后细胞Ⅰ型胶原基因的表达。 结果与结论：高、中、低浓度富血小板血浆组骨髓间充质干细胞均保持较高的增殖活性,呈快速生长,曲线上升幅度大,与空白对照组比较差异有显著性意义(P < 0.05)。培养时间越长作用越明显,培养一定时间后其作用具有剂量依赖性,较高剂量的富血小板血浆对细胞的增殖作用较为明显。富血小板血浆能明显促进骨髓间充质干细胞的Ⅰ和Ⅲ型胶原合成,剂量越大,刺激胶原产生的作用越明显。说明骨髓间充质干细胞具备组织工程化肌腱种子细胞的基本条件,富血小板血浆具有促进间充质干细胞向肌腱细胞转化的作用。     

抗坏血酸、β-甘油磷酸钠和地塞米松联合诱导大鼠骨髓间充质干细胞向成骨细胞的分化*

背景：成骨细胞来源于骨髓中的间质干细胞,但骨髓间充质干细胞经过高度扩增后,细胞群会出现生长速率减慢等变化,并出现没有分裂倾向的扁平状细胞。 目的：进一步验证在一定诱导条件下,体外分离培养的大鼠骨髓间充质干细胞向成骨细胞的定向分化情况。 设计、时间及地点：细胞学体外对照观察,于2007-03/10在南方医科大学解剖实验室完成。 材料：4周龄SD大鼠3只,由南方医科大学实验动物中心提供。成骨诱导过程所使用的抗坏血酸、地塞米松、β-甘油磷酸钠为美国 Sigma公司产品。 方法：采用密度梯度离心+贴壁筛选法体外分离纯化大鼠骨髓间充质干细胞,融合后用EDTA及胰蛋白酶消化,按1∶3传代培养。取生长良好的第2代骨髓间充质干细胞,调整细胞数量为1×107 L-1,分为2组：对照组加入含体积分数为0.1胎牛血清的DMEM-LG培养基,诱导组加入成骨诱导液进行培养,成骨诱导液为含50 mg/L抗坏血酸、0.1 μmmol/L地塞米松、0.5 mmol/Lβ-甘油磷酸钠、体积分数为0.1胎牛血清的DMEM-LG培养基。 主要观察指标：骨髓间充质干细胞的生物学特性,成骨诱导前后细胞碱性磷酸酶活性,诱导后矿化结节的形成。 结果：刚接种的骨髓间充质干细胞呈圆形;原代培养24 h后大部分细胞贴壁生长,呈短梭形、三角形、多边形;72 h时贴壁细胞分裂增殖,逐渐呈长梭形;至第5天可见明显细胞集落形成;第9~10天细胞达80%以上融合;传代后细胞贴壁和增殖速度加快,呈有规则的方向性排列。与诱导前比较,骨髓间充质干细胞成骨诱导7 d后碱性磷酸酶活性明显提高（P < 0.05）。连续成骨诱导20 d后,诱导组可见多个散在分布的圆形不透明钙化结节,对照组未见矿化结节沉积。 结论：在抗坏血酸、β-甘油磷酸钠和地塞米松联合诱导下,大鼠骨髓间充质干细胞可定向分化为成骨细胞。     

瘦素对人骨髓间充质干细胞成骨分化的影响

背景：瘦素及其受体在中枢和外周多个部位均有表达,具有多种生物学功能,对于骨代谢有着重要的影响作用,但目前瘦素影响骨重建的机制尚未完全明了。 目的：探讨瘦素对人骨髓间充质干细胞成骨分化能力的影响。 设计、时间及地点：细胞学体外观察,于2008-03/2008-09在山西医科大学生化与分子生物学实验室完成。 材料：健康志愿者髂骨骨髓由山西医科大学第二医院提供。瘦素为Sigma公司产品。 方法：采用全骨髓法体外分离培养人骨髓间充质干细胞,传至第3代以1×108 L-1密度接种至预置盖玻片的6孔培养板中,设立3组：成骨诱导组添加原代培养液后,再加入含10-8 mol/L地塞米松、10 mmol/L β-磷酸甘油、50 mg/L维生素C的成骨诱导培养基;成骨+瘦素诱导组添加成骨诱导培养基后,再加入50 nmol/L瘦素;空白对照组仅加入含体积分数为10%胎牛血清的LG-DMEM培养液。 主要观察指标：骨髓间充质干细胞表面标志表达、钙化结节染色结果、碱性磷酸酶活性、Ⅰ型胶原及骨钙素含量、骨保护素和RANKL蛋白的表达。 结果：第3代骨髓间充质干细胞CD44和CD71阳性率分别为95.21%,72.31%,CD34阳性率仅为0.39%。成骨诱导21 d后von Kossa染色可见呈棕黑色的细胞外基质钙盐沉积。诱导14 d与空白对照组比较,成骨诱导组、成骨+瘦素诱导组骨髓间充质干细胞内碱性磷酸酶活性及Ⅰ型胶原、骨钙素含量均明显升高(P < 0.05);且成骨+瘦素诱导组各指标升高幅度明显高于成骨诱导组(P < 0.05)。与成骨诱导组比较,成骨+瘦素诱导组骨髓间充质干细胞骨保护素蛋白的表达明显上调(P < 0.05),RANKL蛋白的表达明显下调(P < 0.05)。 结论：瘦素作用于人骨髓间充质干细胞后可促使其向成骨细胞分化,可能通过骨保护素/RANKL途径发挥对骨代谢的调节作用。     

大鼠骨髓间充质干细胞体外向成骨细胞分化培养的生物学特性

背景：骨髓间充质干细胞因取材方便、对机体损伤小,是目前最为合适的骨组织工程种子细胞,但其体外培养的具体方法及生物特性仍无定论。 目的：建立一种简单有效的骨髓间充质干细胞的体外培养及成骨诱导方法,并探讨其体外培养的生物学特点。 方法：采用贴壁法分离提纯Wistar大鼠骨髓间充质干细胞,传至第3代细胞后,分别在普通培养基(对照组)和成骨诱导培养基(实验组)中培养10 d,绘制细胞生长曲线。于培养第4,7,10,13,16天检测两组细胞碱性磷酸酶活性,并对细胞爬片行Von kossa染色。 结果与结论：采用贴壁法获得了均一性较好的骨髓间充质干细胞,对照组细胞生长速度明显快于实验组细胞。对照组细胞碱性磷酸酶活性明显低于实验组(P < 0.05)。实验组细胞Von kossa染色为阳性,对照组为阴性。说明贴壁筛选法是一种简单有效的骨髓间充质干细胞的分离纯化方法,骨髓间充质干细胞在体外可诱导分化为成骨细胞。     

富血小板血浆促进脂肪间充质干细胞的体内外成骨****☆

背景：添加富血小板血浆可促进细胞体外成骨表型的快速转化,从而有效成骨。 目的：观察富血小板血浆对脂肪间充质干细胞体内和体外成骨能力的影响。 方法：第3代兔脂肪间充质干细胞进行成骨诱导培养,分为对照组和富血小板血浆组。细胞接种到钙磷陶瓷支架上后,体内外观察细胞/载体复合物的成骨情况。 结果与结论：两组细胞随着诱导时间的延长碱性磷酸酶活性增高,达到高峰值后随后逐渐下降,诱导后14 d时,富血小板血浆组即达到高峰值,对照组18 d达到高峰值。细胞/载体复合体切片Von Kossa染色显示两组载体的孔隙内衬面呈多层黑染状,有大量钙盐沉积。甲苯胺蓝染色显示载体的孔隙中可见成熟的骨质存在,周边区域较中心多。体外钙盐沉积对照组多,体内成骨面积富血小板血浆组多(P < 0.05)。说明,富血小板血浆可有效诱导脂肪间充质干细胞体内和体外成骨。