两种分离脐血间充质干细胞的方法比较*★

背景：目前分离脐血间充质干细胞的方法很多，尚没有确定一种为最有效的方法。 目的：寻找一种最为可靠的脐血间充质干细胞分离方法。 方法：应用Percoll分离液法和羟乙基淀粉沉降法对脐血进行分离得到单核细胞，在含体积分数15%新生牛血清的DMEM/F12培养基中进行培养并传代。观察不同分离方法脐血单核细胞的回收率，每次传代的时间和细胞增值速度，培养过程中间充质干细胞形态的变化情况，并用流式细胞仪检测第3代细胞表面标志物CD90、CD44、CD34的表达。 结果与结论：与Percoll分离液法相比羟乙基淀粉沉降法获得的单核细胞多，单核细胞回收率高(P < 0.01)，第1次传代时间短(P < 0.01)。然而两种方法获得的细胞经培养在形态的变化和表面标志物CD90、CD44、CD34的表达上差异并无显著性意义(P > 0.05)。所以羟乙基淀粉沉降法的分离效率较高，培养时间短，但是并不能获得质量较高的脐血间充质干细胞。     

脐血间充质干细胞分离扩增及向成骨与脂肪细胞的分化

背景：和骨髓间充质干细胞相比，脐血间充质干细胞取材方便，其免疫原性较低，能耐受更大程度上的HLA配型不符，分离出的间充质干细胞纯度更高。 目的：分析新生儿脐血间充质干细胞体外分离、纯化、扩增，以及向成骨及脂肪细胞定向诱导分化的方法与条件。 设计、时间及地点：观察性实验，于2004-09/2005-11在四川大学华西医院生物治疗国家重点实验室，干细胞与组织工程研究室完成。 材料：胎龄37~40周的新生儿脐血。 方法：以Ficoll-HyPaque 淋巴细胞分离液密度梯度法、沉降红细胞后密度梯度法及CD34+免疫磁珠负选法分离脐血单个核细胞。将分离获得的单个核细胞采用L-DMEM培养基+体积分数0.1胎牛血清或MesencultTM培养基+体积分数0.1胎牛血清进行间充质干细胞培养传代，获得的第3代集落生长细胞进行流式细胞仪表面抗原测定，并诱导其向成骨、脂肪细胞分化。 主要观察指标：①脐血间充质干细胞的鉴定。②经茜素红染色及油红染色证实其诱导分化。 结果：经沉降红细胞后密度梯度离心分离的单个核细胞，使用MesencultTM培养基+体积分数0.1胎牛血清培养成功率高，第3代可出现明显的集落生长，而另两种方法分离培养的细胞则难以形成集落；集落细胞表面抗原测定表达CD29，CD59，D71，不表达CD34，CD45及HLA-DR等分子。成骨定向诱导分化的集落细胞经茜素红染色胞浆中出现有大量的钙沉积，成脂肪定向诱导分化的集落细胞油红染色示胞浆充满油滴空泡。 结论：使用MesencultTM培养基+体积分数0.1胎牛血清培养由甲基纤维素沉降脐血红细胞后密度梯度离心分离的单个核细胞培养成功率高，第3代可出现明显的集落生长。经诱导后可分化为成骨细胞和脂肪细胞。     

不同血清微环境对大鼠骨髓间充质干细胞体外培养的影响**☆

背景：骨髓间充质干细胞在培养过程中,常在基础培养基中添加一定的血清,最常见的是小牛血清和胎牛血清,但这存在着一定的生物安全性隐患。 目的：观察不同血清微环境对大鼠骨髓间充质干细胞体外培养的影响。 方法：自成年大鼠骨髓中分离骨髓间充质干细胞,采用全骨髓贴壁法培养。分别以下列血清微环境培养：自身血清组：分离细胞后原代用含大鼠自身血清的培养基培养,传代后换用含胎牛血清的培养基培养;同种异体血清组：分离细胞后原代用含同种异体血清的培养基培养,以后用胎牛血清培养基培养;胎牛血清组：分离后用含胎牛血清培养基培养,以后一直用含胎牛血清培养基培养;DMEM组：分离细胞后原代用不含血清的DMEM培养基培养,传代后换用含胎牛血清的培养基培养。在倒置相差显微镜下观察细胞的形态;细胞的贴比率;生长曲线;流式细胞仪观测细胞表面CD11b、CD45和CD90表达。 结果与结论：大鼠自身血清微环境及同种异体血清微环境细胞形态均一性、在融合度均高于其他组;首次传代天数低于其他组。24,48,72 h贴比率自身血清组、同种异体血清组和胎牛血清组均高于DMEM组(P < 0.01)。在细胞生长曲线中大鼠自身血清组倍增速率最快,其次为同种异体血清组,再者为胎牛血清组,而DMEM组细胞未见明显倍增现象。流式细胞仪检测含血清培养基培养条件下各组第3代细胞CD11b和CD45阳性细胞率均达到98%以上,CD90阳性率小于2%,可以得到纯度较高的骨髓间充质干细胞。但是在无血清微环境条件下,CD11b的阳性率为95.83%、CD90阳性率达2.07%,而CD45阳性率仅为64.79%,可见无血清环境下培养的骨髓间充质干细胞纯度明显低于含血清微环境。提示大鼠自身血清微环境下更有利于骨髓间充质干细胞的贴壁、生长及纯化。     

人胎盘间充质干细胞4种消化分离方法的效果比较

背景：目前已从多种组织器官中分离出间充质干细胞,如何更高效地获取大批量纯度佳的干细胞仍是研究目标之一。 目的：对人胎盘间充质干细胞采取4种不同的消化分离方法,比较其分离效果。 设计、时间及地点：细胞学体外对比观察,于2007-07/2008-01在暨南大学医学院血液病研究所完成。 材料：胎盘标本来源于足月正常剖宫产胎儿,由暨南大学附属第一医院提供。胶原酶Ⅱ、胶原酶Ⅳ为GIBCO产品,羟乙基淀粉为B.BRAUN产品,淋巴细胞分层液为上海试剂二厂产品。 方法：胎盘组织剪碎后平均分为4组：胶原酶Ⅳ+羟乙基淀粉沉淀组、胶原酶Ⅱ+羟乙基淀粉沉淀组、胶原酶Ⅱ+淋巴细胞分层液分离组、胶原酶Ⅱ+氯化铵裂解红细胞组,5份标本/组。将第1组置于1 g/L胶原酶Ⅳ中,另外3组置于1 g/L胶原酶Ⅱ中,37 ℃消化45 min。过筛后收集各组细胞悬液,按组别对应施以羟乙基淀粉沉淀法、淋巴细胞分层液分离法、氯化铵裂解红细胞法进行分离。 主要观察指标：观察4种方法在获取细胞数、培养成功率、细胞出现伸展时间、原代培养时间方面的差异,并对培养得到的细胞进行表面标志检测。 结果：与胶原酶Ⅱ+羟乙基淀粉沉淀组比较,其余3组获取的细胞数均明显减少（t=2.92~8.16,P < 0.05）。在其他条件相同的情况下,胶原酶Ⅱ+羟乙基淀粉沉淀组培养成功率为100%,其余3组分别为80%,80%,20%。胶原酶Ⅱ+羟乙基淀粉沉淀组细胞出现伸展时间及原代培养时间均短于胶原酶Ⅱ+淋巴细胞分层液分离组（t=5.27~5.37,P < 0.05）,亦短于胶原酶Ⅳ+羟乙基淀粉沉淀组（2.46~2.50,P < 0.05）。流式细胞仪检测示第3代人胎盘间充质干细胞强表达透明质酸受体CD44和整合素家族成员CD29,不表达造血干细胞标志CD34和CD45,也不表达内皮细胞标志CD106及HLA-DR。 结论：使用胶原酶Ⅱ消化胎盘组织,结合羟乙基淀粉沉淀法能较好地分离人胎盘间充质干细胞。     

羟乙基淀粉一步与两步法分离骨髓单个核细胞及血小板的比较

背景：羟乙基淀粉和淋巴细胞分离液两步法分离骨髓有核细胞,可以提高单个核细胞的浓缩效率,但对血小板残留量的研究未见报道。 目的：明确羟乙基淀粉两种分离方法浓缩骨髓单个核细胞的效率和残留血小板的量。 方法：骨髓来自在新疆医科大学第一附属医院行成体自体骨髓有核细胞移植治疗相关疾病分离骨髓的检测标本。采用羟乙基淀粉自然沉降和羟乙基淀粉沉降后再用淋巴细胞分离液分离骨髓细胞。观察两种方法分离骨髓细胞后有核细胞、单个核细胞、血小板数。 结果与结论：羟乙基淀粉两步法分离骨髓后有核细胞悬液中单个核细胞均值为89%,一步法为45%。两步法浓缩单个核细胞的百分率高于一步法(P < 0.05);残留血小板数(中位数：73.00)低于一步法(中位数：367.50)(P < 0.05)。结果表明,羟乙基淀粉和淋巴细胞分离液两步法分离骨髓细胞中单个核细胞和血小板的效果优于一步法。     

人脐血间充质干细胞培养及对异体外周血T淋巴细胞增殖的影响*☆

目的：研究发现间充质干细胞具有独特的免疫调节特性，体外能够抑制混合淋巴细胞培养或有丝分裂原刺激中的T淋巴细胞增殖。实验观察体外分离培养的脐血间充质干细胞对异体外周血T淋巴细胞增殖的抑制效果。 方法：实验于2004-10/2006-06在解放军兰州军区兰州总医院完成。①对象：足月正常分娩产妇脐血及健康志愿者外周血分别由解放军兰州军区兰州总医院妇产科、血液科提供，产妇与志愿者对实验均签署知情同意书，实验经医院医学伦理委员会批准。②实验方法：Percoll法分离脐血单个核细胞，贴壁纯化，达80%~90%融合时胰蛋白酶消化，按2.0×108 L-1密度传代，取第4~5代细胞用于实验。密度梯度法分离外周血单个核细胞，以含体积分数为0.2胎牛血清的RPMI 1640培养基调整细胞浓度至1×109 L-1时加入尼龙棉柱内，用培养基冲出非黏附细胞即为T淋巴细胞。脐血间充质干细胞分为2×108，1×108，0.5×108 L-1 组，各100 μL接种于96孔培养板，加入2×108 L-1 T淋巴细胞悬液100 μL，再给予植物血凝素刺激T淋巴细胞转化。以T淋巴细胞+植物血凝素为阳性对照。③实验评估：观察体外培养的脐血间充质干细胞形态，应用流式细胞仪检测细胞表面抗原的表达。MTT法测定脐血间充质干细胞对异体外周血T淋巴细胞增殖的影响。 结果：①形态特征与表面抗原表达：原代培养10~18 d形成平行排列、辐射状或旋涡状的成纤维样细胞，即为脐血源性的间充质干细胞，传代7 d左右细胞达90%融合。流式细胞仪检测90%细胞稳定表达间充质干细胞相关抗原CD13，CD29，CD44，CD166，不表达造血细胞系的表面抗原CD34，CD45。②脐血间充质干细胞对异体T淋巴细胞增殖的抑制：与阳性对照比较，经脐血间充质干细胞共培养后植物血凝素刺激T淋巴细胞的增殖作用受到抑制，增殖指数明显降低(P < 0.01)。间充质干细胞与T淋巴细胞比值为1:1，1:2和1:4时的增殖抑制率分别为(48.16±2.31)%，(34.47±3.09)%，(22.15±2.63)%。 结论：脐血间充质干细胞可显著抑制异体外周血T淋巴细胞的增殖，该抑制作用呈剂量依赖性。     

改良法体外培养脐带血间充质干细胞及其生物学特性分析

背景：目前报道的脐带血间充质干细胞分离成功率较低，且缺乏较为统一的鉴定方法。 目的：对传统的体外分离培养脐带血间充质干细胞方法加以改良，以提高细胞培养成功率，并进行生物学特性观察。 设计、时间及地点：细胞学体外观察，于2006-04/2007-01在上海交通大学医学院附属第九人民医院完成。 材料：取自足月健康顺产新生儿的脐带血标本28份，由上海市红房子医院产科提供，经产妇和家属同意。 方法：无菌条件下取新生儿脐带血，以密度梯度离心法分离单个核细胞，以含体积分数为10%胎牛血清的α-MEM培养基进行体外培养，原代培养5~7 d后半量换液，后每隔三四天全量换液一次。待细胞贴壁后，按处理方法不同分为2组：改良1组当皿底圆形巨核细胞融合、梭形成纤维样细胞脱落时将细胞悬液移入新的皿中培养；改良2组待皿底圆形巨核细胞渐渐占据优势时，将培养基换为含体积分数为15%小牛血清的α-MEM培养液，当圆形巨核细胞大部脱落后换回含体积分数为10%胎牛血清的α-MEM培养基。取第5代脐带血间充质干细胞，进行体外成骨及成脂诱导。 主要观察指标：显微镜下观察脐带血间充质干细胞的形态，流式细胞仪测定细胞免疫表型，碱性磷酸酶染色及油红染色检测细胞诱导分化能力。 结果：28份脐带血中20份培养出贴壁细胞(改良1组6份/10份，改良2组14份/18份)，其中13份培养出能融合且可稳定传代的成纤维样细胞(改良1组4份，改良2组9份），成功率为46.4%，可传至22代且形态无变化，强烈表达CD105、CD29等间充质干细胞表面标志，而CD34、CD45和CD106等呈阴性表达。在特定诱导条件下，脐带血间充质干细胞可分化为成骨细胞和脂肪细胞。 结论：脐带血中存在间充质干细胞，具有多向分化潜能，且易于体外扩增、传代稳定，体外培养方法经改良后可提高脐带血间充质干细胞的培养成功率。     

来源于骨髓、外周血与脐带血的间充质干细胞生物学特性比较

背景：间充质干细胞存在于人体多种组织,目前研究报道所用细胞来源单一,培养方法差异大,得出的结果不一致,不能证明分离、培养出的细胞是相同的细胞,难以比较。 目的：课题提出在体外培养条件下可对同一个体来源的骨髓、外周血来源间充质干细胞及不同个体脐带血来源间充质干细胞的生物学特性进行比较的理论假设。 设计、时间及地点：细胞学体外对照观察,于2007-06/2008-12在解放军海军总医院血液科完成。 材料：解放军海军总医院血液科造血干细胞移植供者10例,取同一供者的骨髓、外周血细胞,细胞体积分别为20 mL与2 mL。解放军海军总医院产科10例健康初产妇脐带血细胞,细胞体积为30 mL。 方法：采用Percoll密度梯度+贴壁法分离骨髓、外周血、脐带血来源的间充质干细胞,加入含体积分数为10%胎牛血清的DMEM/F12培养基。当细胞生长汇合至80%~90%时胰蛋白酶-EDTA消化,制成5×108 L-1细胞悬液,计为P0。重复上述操作,即为P1,依此类推P2~P5。 主要观察指标：细胞生长形态观察,细胞瑞氏-吉姆萨染色结果,细胞化学染色结果,细胞增殖数量,流式细胞仪检测细胞表面标记。 结果：①骨髓间充质干细胞贴壁时间、汇合至50%时间、汇合至80%时间均早于外周血、脐带血间充质干细胞;骨髓间充质干细胞培养5~7 d时呈漩涡状生长,而外周血、脐带血间充质干细胞无此生长特性。②初始培养和传代培养后,骨髓间充质干细胞多为成纤维样细胞,仅有少量内皮样细胞;而传至第5代的外周血、脐带血间充质干细胞除有成纤维样细胞外,还有较多的内皮样细胞和单核-巨噬样细胞。③P1~P5骨髓、外周血及脐带血来源间充质干细胞PAS染色、碱性磷酸酶染色、苏丹黑B染色均呈阴性。④与P0细胞比较,传代培养至P5后骨髓间充质干细胞增殖数量明显多于外周血、脐带血间充质干细胞(P < 0.05)。⑤CD29,CD44,CD90,CD71,CD105,CD166和HLA-ABC阳性率,骨髓间充质干细胞接种后≤6%, P0~P5为55.9%~92.8%;外周血间充质干细胞接种后≤10%,P0~P5为19.7%~33.4%;脐带血间充质干细胞接种后≤20%,P0~P5为35.4%~93.2%。CD34,CD45和HLA-DR阳性率,3种来源的间充质干细胞均极低。CD14,CD31阳性率,骨髓间充质干细胞极低,外周血间充质干细胞为12.1%~28.3%,脐带血间充质干细胞为8.1%~21.3%。 结论：结果显示在体外培养条件下,骨髓、外周血和脐带血均能较好地形成间充质干细胞,以骨髓来源的间充质干细胞含量最高,成分单一,而脐带血和外周血含量次之,细胞成分多。     

不同血清培养条件下骨髓间充质干细胞的增殖

背景：目前,分离培养骨髓间充质干细胞应用最为广泛的细胞生长添加剂是胎牛血清/小牛血清,应用脐血清进行骨髓间充质干细胞培养的相关研究较少。 目的：观察不同血清培养对骨髓间充质干细胞增殖的影响。 方法：用Ficoll密度梯度离心法分离纯化骨髓间充质干细胞,在含脐血清、胎牛血清以及无血清的L-DMEM培养基中培养,观察各组细胞形态、增殖情况;应用流式细胞术对细胞表面抗原CD34、CD44、CD45、CD105进行表型鉴定。 结果与结论：脐血清培养后细胞形态较小,似纺锤状,细胞呈网状生长;胎牛血清培养后细胞呈梭形成纤维细胞样,呈集落样生长;脐血清和胎牛血清均能促进细胞生长增殖,但骨髓间充质干细胞在脐血清中增殖更活跃,无血清培养基本无增殖。流式细胞鉴定显示CD34、CD45阴性,CD44、CD105阳性,脐血清扩增后骨髓间充质干细胞的表面标记无明显改变。     

脂肪间充质干细胞的分离培养和鉴定

背景：近年来的研究发现,在脂肪组织中也存在这与骨髓间充质干细胞类似的间充质干细胞。脂肪组织可以从美容吸脂中获得,来源丰富,取材方便,蕴藏着巨大的临床应用价值。 目的：分离培养人脂肪间充质干细胞并检测其生物学特性。 方法：用离心的方法获得人脂肪间充质干细胞,接种于含体积分数为10%胎牛血清的DMEM培养基中行贴壁培养。并进行细胞形态学观察,绘制细胞生长曲线,流式细胞仪检测细胞表面抗原。 结果与结论：采用消化、离心分离获得的脂肪间充质干细胞大小较为均匀,呈梭形或星形的成纤维细胞样。细胞生长曲线测定表明接后第5天细胞进入指数增生期,至第9天后数量减少;流式细胞仪检测表明超过90%细胞为CD29、CD45和CD105阳性。提示体外分离培养脂肪间充质干细胞生长稳定,可作为组织工程的种子细胞。     

人脐带血间充质干细胞的分离培养及增殖能力*

背景：随年龄的增加，骨髓来源的间充质干细胞在数量和质量上均受到影响，并对供体损伤较大，寻找替代的间充质干细胞来源成为研究热点，而脐带血中是否含有间充质干细胞仍存在争议。 目的：拟从人脐带血中分离培养间充质干细胞，并对其生物学特性进行检测。 方法：无菌条件下，应用Percoll密度梯度离心法分离脐血标本，收获中间层细胞，加入含胎牛血清、青霉素和链霉素、L-谷氨酰胺的DMEM基础培养液，再经反复贴壁纯化，除去悬浮生长细胞，得到较多呈融合状态的贴壁细胞，待细胞达60%~80%融合时胰酶消化传代。分别取第1，5，9代细胞，观察细胞形态变化，流式细胞仪检测细胞表面抗原的表达，绘制细胞生长曲线，MTT法检测细胞活性。 结果与结论：分离的脐血间充质干细胞大小均匀，呈梭形或星形的成纤维细胞样细胞。第1，5，9代脐带血间充质干细胞高表达CD29，CD105和CD166，低表达CD34和CD45；接种后5 d细胞进入指数增生期，9 d后数量减少，群体倍增时间为（53.5±8.32）h；细胞生长状态良好，在细胞活力方面1~7代基本相似(P > 0.05)，至第9代细胞增殖活力稍下降，但仍无明显差异(P > 0.05)。结果证实可在体外成功从脐血中分离培养出间充质干细胞，第1~9代细胞均具有良好的增殖能力。     

人脐带血和骨髓来源间充质干细胞的体外分离、培养、分化及

背景：间充质干细胞由于具有自我更新能力且在适宜微环境下具有多向分化潜能,近年来已成为细胞领域的研究热点。 目的：对比观察脐带血与骨髓来源的间充质干细胞其体外分离、纯化及培养条件,并对其进行生物学特性比较。 设计：体外细胞学对比观察。 材料：新鲜脐带血在征得产妇同意后采集。骨髓由健康的成年志愿者捐赠。 方法：取脐带血和成人骨髓分离、培养并纯化间充质干细胞,对获得的间充质干细胞进行形态学观察。 主要观察指标：两种来源间充质干细胞的形态和生长特性;流式细胞仪检测脐带血间充质干细胞表面抗原的表达情况;对脐带血间充质干细胞多向分化的能力进行鉴定。 结果：两种来源的单个核细胞经体外培养贴壁后均出现间充质样细胞,原代骨髓间充质干细胞的贴壁时间和培养时间均短于脐带血间充质干细胞,两种细胞传代生长呈共同特性：传代培养潜伏期为24~36 h,传代培养对数增殖期为接种后3～7 d,接种后八九天,生长进入平台期;脐带血来源的间充质干细胞表达相关抗原CD29、CD44、CD105;但不表达造血细胞抗原CD34、CD45;脐带血间充质干细胞可诱导分化为脂肪细胞、成骨细胞。 结论：人脐带血和骨髓来源间充质干细胞均可在体外分离培养、扩增;脐带血的间充质干细胞原代贴壁时间、形成细胞克隆的时间、集落交错融合的时间均较骨髓间充质干细胞晚,传代培养的细胞形态,生长速度均无明显差异;两种来源的间充质干细胞具有相同的表面标志物;脐带血间充质干细胞有多项分化潜能,可诱导为脂肪细胞、成骨细胞。     

人脐带间充质干细胞体外长期培养及向肝样细胞的分化

目的：观察人脐带间充质干细胞体外长期培养的生物学特性,探讨其向肝样细胞分化的可能性。 方法：脐带来源于天津市第三中心医院住院的健康足月产妇,采用酶消化法分离培养人脐带间充质干细胞,待细胞生长至80%~90%融合时传代。取传至第9代细胞接种于12孔板内,调整细胞浓度为5×1010 L-1,加入含肝细胞生长因子、成纤维生长因子4、抑瘤素的DMEM培养基,诱导28 d。MTT法测定细胞生长活性,流式细胞仪检测细胞周期,免疫细胞化学及流式细胞仪鉴定细胞表型;免疫细胞化学染色鉴定诱导后肝细胞特异表面标志物的表达,以及糖原染色结果。 结果：从人脐带中分离得到的间充质干细胞贴壁生长,形态类似于成纤维细胞,80%以上处于G0/G1期,具有良好的生长活性,可在体外稳定传代20次以上;CD29,CD90,CD105,Vimentin呈阳性表达,基本不表达造血细胞标志CD34和内皮细胞标志CD31。随诱导时间的延长,圆形细胞逐渐增多,形态似肝细胞;诱导1周时细胞开始表达肝细胞表面标志物甲胎蛋白、细胞胶蛋白18、细胞胶蛋白19;诱导3周时开始表达成熟肝细胞标志白蛋白;诱导4周时白蛋白表达增强,且诱导细胞糖原染色呈阳性。 结论：从人脐带中可成功分离出间充质干细胞,实现体外长期培养,并可诱导分化为肝样细胞。     

离心管贴壁细胞对人脐血单个核细胞体外培养成功率的影响

背景：在常规的脐血间充质干细胞密度梯度离心分离过程中,离心管壁有大量单个核贴壁细胞,这些早期的贴壁细胞是否与脐血间充质干细胞的体外培养成功率低存在一定的联系呢？ 目的：比较4种方法分离人脐血单个核细胞的体外培养成功率,观察离心管贴壁细胞对人脐血单个核细胞体外培养成功率的影响。 方法：取足月健康顺产新生儿脐血36份,随机分为4组,每组9份,于采集后6 h内分别采用甲基纤维素沉降法(A组)、密度梯度离心分离法(B组)、甲基纤维素联合密度梯度离心分离法(C组)、甲基纤维素联合改良密度梯度离心分离法(D组)分离出单个核细胞,锥虫蓝染色检测细胞活力,用细胞计数板进行细胞计数,调整细胞浓度为1×109 L-1~2×109 L-1,接种于含体积分数为10%胎牛血清的低糖DMEM培养基中培养和传代,相差显微镜下观察脐血单个核细胞的形态。收集第3代脐血单个核细胞,采用细胞计数板进行计数,计算扩增倍数,采用流式细胞仪鉴定细胞免疫表型。 结果与结论：36份脐血中,成功分离33份脐血单个核细胞,B组有3份分离失败。33份中共22份原代培养中出现大量贴壁细胞,其中A组8份,B组2份,C组5份,D组7份。9份(27%)培养出能融合且可稳定传代的成纤维样细胞,其中A组3份,B组0份,C组1份,D组5份。4组脐血单个核细胞在原代培养5~7 d后均可见数量不等的贴壁细胞,呈梭形成纤维样细胞或(和)圆形巨核样细胞。A组与D组于原代培养三四周可见成纤维样细胞集落形成,细胞形态与骨髓间充质干细胞相似,呈较均一的长梭形,可稳定培养至60~90 d形态无明显变化。流式细胞仪免疫检测,第3代脐血单个核细胞不表达或弱表达CD34、CD45和CD106等造血干细胞和内皮细胞标志,但显著表达CD29、CD105等间充质干细胞表面标志。结果显示离心管贴壁细胞可显著提高脐血单个核细胞的体外培养成功率,而甲基纤维素联合改良的密度梯度离心分离法,可充分回收离心管贴壁细胞,利于脐血单个核细胞的体外扩增和稳定传代。     

兔骨髓基质细胞的体外培养及鉴定

背景：骨髓基质细胞的分离纯化、细胞培养、细胞标记、诱导因子、基因转染对细胞生物学影响、细胞载体构建及细胞复合物回植时间的选择等尚处于实验研究阶段。 目的：摸索一种较为简便且可有效获得骨髓基质细胞的体外培养方法。 设计、时间及地点：细胞学体外实验，于2006-06/2007-01在中国科学院北京基因组研究所完成。 材料：SPF级6周龄新西兰大白兔8只，由中国科学院遗传发育研究所实验动物中心提供。 方法：无菌条件下抽取兔骨髓1 mL，D-Hanks液稀释后，离心弃上清，DMEM培养基重悬，制备单细胞悬液，叠加在密度为1.077的等体积淋巴细胞分离液的液面上，离心后取界面云雾状的单个核细胞层，用含有20%胎牛血清的DMEM培养基重悬。以1×10/cm2接种后贴壁法纯化细胞，待70%~80%长满单层后消化传代。 主要观察指标：倒置显微镜下观察细胞生长情况，锥虫蓝染色计数活细胞，苏木精-伊红染色对细胞进行鉴定，MTT法检测细胞活性，观察传代培养的细胞冻存后复苏情况。 结果：接种24 h后细胞开始贴壁，呈短梭形或三角形，且有长短不等的细胞突起；3 d后贴壁细胞开始分裂增殖，部分区域形成细胞团簇；1周后大部分细胞呈成纤维状散落在培养瓶底生长；传代后细胞均匀分布，形态呈细长梭形，并沿一定方向排列，1 mL骨髓基质细胞悬液传3代后的贴壁细胞数可达5×106~1×107数量级。骨髓基质细胞成活率约为90%，经鉴定为单核细胞，接种后1~6 d细胞持续旺盛生长，至第8天细胞活性最高，随后生长活性下降。复苏冻存56 d的细胞，其生长良好，增长迅速。 结论：以淋巴细胞分离液梯度离心后可获得纯度较高的骨髓基质单核细胞，经体外扩增培养能够得到足够数量的种子细胞，冻存复苏后细胞活性无变化。     

脐带间充质干细胞对脐血CD34+细胞体外扩增的影响

背景：体外扩增是目前解决脐带血干细胞移植所面临的单份脐血造血干祖细胞数不足问题的主要手段。已有许多关于不同来源的间充质干细胞联合不同细胞因子支持脐血造血干祖细胞体外扩增的报道,而单独应用间充质干细胞对人脐血CD34+细胞体外扩增的报道仍很少。 目的：观察应用脐带源间充质干细胞作基质层的体外培养体系对脐血CD34+细胞体外扩增的支持作用。 设计、时间及地点：对比观察实验,于2006-03/2007-05在中国医学科学院中国协和医科大学血液学研究所、实验血液学国家重点实验室完成。 材料：经产妇知情同意,采集健康足月分娩胎儿脐带9份。 方法：应用贴壁培养的方法从正常足月出生儿脐带中分离培养间充质干细胞,通过细胞形态学、免疫表型、分化实验进行鉴定。利用免疫磁珠分离法从正常足月出生儿脐带血中分离CD34+细胞。应用3种不同培养体系进行脐血CD34+细胞的体外扩增：单独应用脐带源间充质干细胞作基质层、细胞因子培养体系和间充质干细胞联合细胞因子培养体系。 主要观察指标：应用细胞计数法、集落培养计数法和流式细胞学检测法对扩增后细胞数量、集落形成能力和免疫表型进行分析比较。RT-PCR检测间充质干细胞中细胞因子的表达情况。 结果：培养第14天后,间充质干细胞组的CD34+细胞比例明显高于细胞因子联合间充质干细胞组;CD34+细胞总数为培养前的(4.19±1.37)倍,明显高于细胞因子组。培养第7天和第14天,间充质干细胞组的CD34+CD38-细胞亚群比例均高于另两组。RT-PCR结果显示,脐带源间充质干细胞体外可表达干细胞因子和血小板生成素早期干细胞效应因子。 结论：单独应用脐带源间充质干细胞可有效地对脐血CD34+细胞进行体外扩增,更有利于保持较早期干、祖细胞的扩增。 关键词：间充质干细胞;脐带;脐血;CD34+细胞;体外扩增     

脐带间充质干细胞的分离培养及诱导分化为多巴胺能样神经元

目的 探索脐带间充质于细胞(MSCs)的分离培养及将其诱导分化为多巴胺能神经元的方法.方法 分离脐带间充质组织,Ⅳ型胶原酶消化分离脐带MSCs,原代培养于含10%FBS的DMEM/F12培养基中,观察细胞形态并应用流式细胞仪检测细胞表面标志物和细胞周期,CCK8法绘制细胞生长曲线;采用二步法诱导分化P3代脐带MSCs,培养3、6、9 d后终止诱导,应用免疫荧光染色和Wcstern blotting检测分化后细胞酪氨酸羟化酶(TH)、神经元特异性烯醇化酶(NSE)的表达.结果 分离培养的脐带MSCs形态呈相对均一的成纤维样细胞,平行排列或旋涡状生长.P3代细胞CD29、CD44、CD73、CD90、CD105、CD166表达阳性,而CD34、CD45、CD19、CD31、HLA-DR表达阴性.对数生长期细胞倍增时间为48 h,处于G0～G1期细胞占91.13%;诱导分化后细胞多数为两级,形态与神经元相似,免疫荧光染色检测结果显示诱导9 d时细胞NSE、TH染色阳性率分别为19.5%和8.9%,Weston blotting检测结果显示诱导6 d时细胞NSE表达明显,TH仅有弱表达,诱导9 d时TH、NSE均表达明显.结论 脐带间充质组织中能分离出MSCs,且能分化成多巴胺能神经元.

Abstract：

Objective To investigate the methods of isolation of human umbilical cord mesenchymal stem cells (MSCs) in Wharton' s jelly and the differentiation of MSCs into dopaminergic neurons. Methods The umbilical cord mesenchymal tissue was scraped off from the Wharton's jelly,and then, collagenase Ⅳ was employed to isolate the MSCs. The isolated cells were primarily cultured in DMEM/F12 medium containing 10% FBS. Inverted microscopy was used to observe the cytomorphology, and flow cytometry was employed to detect the cell surface antigens and the cell cycle.We evaluated the cell viability using CCK8 kit. Two-step method was employed to induce the MSCs of the P3 generation to differentiate into dopaminergic neurons, and immunocytochemistry and Western blotting were used to detect the expressions of neuron specific enolase (NSE) and tyrosine hydroxylase (TH) 3, 6 and 9 d after the induction. Results The isolated MSCs showed fibroblast-like shape, with parallel arrangement and vortex-like growth. MSCs of the P3 generation expressed CD73, CD29, CD44and CD105, but did not express CD34, CD45, CD106 and HLA-DR. The doubling time in the exponential phase was at the 48th h of culture, and 91.13% cells were under G0-G1. These cells had similar morphology of the neurons. The immunocytochemical assay showed that the NSE and TH positive rates were 19.5% and 8.9% on the 9th d of induction; and Western blotting showed that MSCs obviously expressed NSE and weakly expressed TH.Conclusion MSCs can be isolated from the umbilical cord mesenchymal tissue, and be induced to differentiate into dopaminergic neurons in vitro.     

脐带血清和成人自体血清体外培养人骨髓间充质干细胞的比较

背景：为避免骨髓间充质干细胞培养过程中应用异种血清的排斥以及提高骨髓间充质干细胞培养效率,制备脐带血清体外扩增培养骨髓间充质干细胞是目前的研究热点。 目的：比较脐带血清和成人自体血清体外培养人骨髓间充质干细胞的生物学特性。 设计、时间及地点：开放性实验,于2006-10/2008-06在中南大学湘雅二医院细胞生物实验室完成。 材料：16份骨髓标本由中南大学湘雅二医院和湖南省湘潭市中心医院提供。 方法：采用Ficoll Paque细胞分离液从16例新鲜成人骨髓穿刺液中分离骨髓间充质干细胞,分别用含体积分数为10%脐带血清、成人自体血清的DMEM/F12培养基培养,取第4代细胞进行实验。流式细胞仪检测细胞表面抗原,成骨诱导体系及脂肪诱导体系分别诱导各组骨髓间充质干细胞定向分化,通过细胞形态观察、免疫表型及免疫化学染色进行鉴定。 主要观察指标：①细胞形态。②骨髓间充质干细胞计数和细胞周期。③表面标志物的鉴定。④免疫组织化学染色观察骨髓间充质干细胞诱导成骨、成脂情况。 结果：①脐带血清组培养的骨髓间充质干细胞在增殖数量和速度上优于成人自体血清组(P < 0.05)。两种血清培养条件下,只有少数细胞处于活跃的增殖期,脐带血清组S期细胞多于成人自体血清组(P < 0.05)。②脐带血清组培养的骨髓间充质干细胞表达CD29、CD73、CD105的阳性率均在90%以上,高于成人自体血清组(P < 0.05);而CD31、CD34、CD45的阳性率均在2%以下,CD31阳性率低于成人自体血清组(P < 0.05)。③脐带血清培养的骨髓间充质干细胞诱导为成骨细胞阳性率和脂肪细胞阳性率均高于自体血清组(P < 0.05)。 结论：脐带血清组培养的骨髓间充质干细胞的纯度和体外诱导分化能力比成人自体血清组高,更适合临床应用。     

人脐血间充质干细胞向类肝细胞分化*

背景：研究表明共培养条件下,骨髓间充质干细胞可向心肌细胞、肝样细胞等方向分化。 目的：探讨人脐血间充质干细胞与人肝细胞在体外共培养条件下,诱导人脐血间充质干细胞分化为类肝细胞的可行性。 方法：无菌条件下采集新生儿脐带血,采用密度梯度离心法与贴壁法分离纯化脐血间充质干细胞,待细胞融合至80%时胰蛋白酶消化传代。应用具有微孔滤膜的插入式细胞培养皿和培养板构建人脐血间充质干细胞-肝细胞共培养模型,脐血间充质干细胞按1×107 L-1密度接种于下层6孔板内,LO2人肝细胞按1×105 L-1密度接种到上层插入式培养皿中。以上、下两层均接种人脐血间充质干细胞作为对照组。采用流式细胞仪检测贴壁细胞的表面标志,倒置相差显微镜观察共培养后细胞形态变化,RT-PCR法检测肝细胞表面抗原mRNA的表达。 结果与结论：贴壁细胞呈长梭形,强表达CD44和CD29,不表达造血细胞表型CD34和CD45。共培养组5 d时长梭形细胞数量减少,随共培养时间的延长,不规则圆形或多角形的细胞逐渐增多,与肝细胞形态相似;对照组培养4周时,人脐血间充质干细胞仍呈形态均一的长梭形。共培养组5 d时甲胎蛋白mRNA呈阳性表达,其余均为阴性;14 d时细胞角蛋白19 mRNA、白蛋白mRNA开始表达,随着时间延长有增强趋势,甲胎蛋白mRNA表达则较前减弱;对照组各抗原的表达均呈阴性。提示与LO2人肝细胞共培养后,人脐血间充质干细胞可诱导分化为类肝细胞。