蛋白激酶CK2α特异性小干扰RNA对喉癌细胞生长的抑制作用

目的探讨蛋白激酶CK2α特异性小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）对人喉癌细胞系Hep-2增殖和凋亡的影响。方法构建蛋白激酶CK2α特异性siRNA表达质粒psiRNA-hHlneo-CK2及非特异性表达质粒psiRNA-hH1 neo-cont，分别用脂质体转染法转染Hep-2细胞。采用逆转录聚合酶链反应、Western Blot技术检测转染后蛋白激酶CK2αmRNA和蛋白表达，采用四甲基偶氮唑蓝法检测转染后Hep-2细胞的增殖情况，流式细胞术检测转染后对Hep-2细胞凋亡的影响。结果转染psiRNA-hH1 neo-CK2载体后，Hep-2细胞蛋白激酶CK2α mRNA和蛋白表达均较非特异干扰组和空白组明显下降（P〈0．05），Hep-2细胞生长缓慢（P〈0．05），其细胞周期出现明显亚二倍体峰（P〈0．05）。结论蛋白激酶CK2α特异性siRNA表达载体可以下调Hep-2细胞蛋白激酶CK2α的表达，抑制细胞增殖并诱导其凋亡。     

Caveolin-1对喉鳞状细胞癌抑制作用的体内外研究

目的探讨caveolin-1对喉鳞状细胞癌（简称鳞癌）细胞生长的影响。方法通过脂质体法转染喉鳞癌细胞株Hep-2细胞，筛选出稳定高表达caveolin-1的克隆，并用实时定量逆转录-聚合酶链反应和免疫印迹法鉴定；用四甲基偶氮唑蓝法检测细胞的体外增殖能力；免疫印迹法检测细胞中表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）、磷酸化EGFR、细胞外信号调节激酶1、2（extracellular signal-regulated kinase，Erk1、2）、磷酸化Erk1、2，caveolin-1蛋白的表达；免疫共沉淀法检测caveolin-1和EGFR的结合情况；转染后的细胞接种至裸鼠皮下，观察肿瘤的生长情况，裸鼠移植瘤中caveolin-1、磷酸化EGFR、磷酸化Erk1、2的蛋白表达用免疫组织化学法检测。结果成功筛选到稳定高表达caveolin-1的克隆；与对照组相比，转染后的细胞体外增殖能力明显减弱；细胞接种到裸鼠皮下，未转染组和转染空载组中裸鼠均形成肿瘤（100％，4／4），稳定转染caveolin-1的Hep-2-CAV1-2组中裸鼠未形成实体肿瘤（0％，0／4），Hep-2-CAVl-3组中4只裸鼠中只有3只形成肿瘤（75％，3／4），但肿瘤生长缓慢，最终生成肿瘤的重量与未转染组相比明显减小（t=3．05，P〈0．05）；免疫共沉淀显示caveolin-1与EGFR在Hep-2细胞中是结合的；免疫印迹法和免疫组织化学法发现转染caveolin-1后细胞中EGFR和Erk1、2的磷酸化水平降低。结论caveolin-1能够抑制喉鳞状细胞癌细胞株Hep-2的生长，抑制EGFR-MAPK信号通路可能与其抑癌作用相关。     

靶向封闭survivin诱导喉癌细胞凋亡及抑制其增殖的体外实验

目的：探讨靶向抑制survivin表达对喉癌细胞凋亡和增殖的影响。方法：构建survivin反义RNA表达载体。用脂质体转染技术将重组质粒转染人喉癌细胞株Hep-2,利用G418（300g／L的维持浓度）筛选,获得稳定转染株（HpEGFP／survivin）。用Western-blot检测survivin反义RNA封闭survivin后蛋白表达效果。吖啶橙染色和流式细胞仪、四唑盐（MTT）和软琼脂集落形成实验分别检测HpEGFP／surivin的凋亡和增殖状态的改变,并与Hep-2和转染空载体的细胞（HpEGFP-C1）进行比较。结果：Western-blot结果表明,构建的survivin反义RNA表达载体部分抑制了Hep-2 survivin蛋白的表达。转染反义survivin RNA载体的HpEGFP／survivin较Hep-2和HpEGFP-CI凋亡增多,其凋亡率较空载体对照组增加1．81倍,而其增殖力下降（P〈0．01）,软琼脂集落形成能力也明显下降（Pd0．05）。结论：构建的survivin反义RNA表达载体部分抑制survivin蛋白的表达,并拮抗了survivin基因的抗凋亡作用,抑制喉癌细胞体外增殖能力和生存能力。     

丙戊酸钠对Hep-2细胞增殖和凋亡的影响及机制的研究

目的:探讨丙戊酸钠(VPA)对体外培养的人喉癌Hep-2细胞凋亡的影响及其机制。方法:不同浓度VPA处理人喉癌Hep-2细胞不同时间后,采用MTT法检测细胞的增殖活性,流式细胞仪检测凋亡率,RT-PCR检测凋亡抑制蛋白Survivin mRNA表达的变化。结果:VPA对人喉癌Hep-2细胞的生长具有明显的增殖抑制作用,其作用表现为剂量依赖性和时间依赖性(P<0.01)。流式细胞仪检测发现:以3 mmol/L的VPA处理Hep-2细胞后,其凋亡率呈时间依赖性上升(P<0.01)。RT-PCR检测发现人喉癌Hep-2细胞Survivin mRNA表达呈时间依赖性下调(P<0.01)。结论:VPA对人喉癌Hep-2细胞具有明显的增殖抑制和诱导凋亡的作用,其作用机制与下调Survivin表达比例有关。     

Beclin1对喉鳞癌细胞Hep-2紫杉醇敏感性影响的体外研究

目的:通过检测不同Beclin1表达水平对喉癌细胞紫杉醇敏感性的影响。方法:本研究利用以喉癌细胞株Hep-2、稳定转染pcDNA3.1-Beclin1质粒的喉癌细胞株Hep-2-Beclin1、稳定转染pcDNA3.1质粒载体的喉癌细胞株Hep-2-pcDNA3.1为研究对象,对3组细胞施加不同浓度的化疗药物紫杉醇(1、2、5、10、20μg/L)干预24h,利用MTT法及流式细胞术检测紫杉醇对3组细胞增殖和凋亡的影响。利用Western blot检测3组细胞Akt和p-Akt蛋白表达水平。结果:不同浓度的紫杉醇处理后的3组喉癌细胞与药物终浓度正相关地出现生长抑制率提高。当紫杉醇浓度大于5μg/L时,紫杉醇对Hep-2-Beclin1的生长抑制率高于对另两株细胞的生长抑制率。以终浓度为10、20μg/L的紫杉醇处理3株喉癌细胞24h后,流式细胞术检测结果显示:各组细胞20μg/L紫杉醇处理后细胞的凋亡率均高于10μg/L紫杉醇处理后细胞的凋亡率(P<0.05)。紫杉醇处理后Hep-2-Beclin1组细胞凋亡率均高于Hep-2组和Hep-2-pcDNA3.1组(P<0.05)。Western blot结果显示:Hep-2、Hep-2-pcDNA3.1、Hep-2-Beclin1细胞Akt相对蛋白表达量分别为:1.24±0.03、1.25±0.05、1.27±0.09,3组细胞间Akt相对蛋白表达量差异无统计学意义(P>0.05);Hep-2、Hep-2-pcDNA3.1、Hep-2-Beclin1细胞p-Akt即活化型Akt相对蛋白表达量分别为:0.98±0.09、1.03±0.04、0.54±0.03,Hep-2-Beclin1细胞p-Akt相对蛋白表达量低于Hep-2、Hep-2-pcDNA3.1组细胞(P<0.05)。结论:Beclin1可能通过抑制PI3K/Akt信号通路的活化上调喉癌细胞对紫杉醇的敏感性。     

串珠素反义cDNA质粒转染对喉癌细胞Hep-2增殖能力的影响

目的：研究串珠素反义cDNA质粒转染对喉癌细胞Hep-2增殖能力的影响。方法：利用阳离子脂质体作为载体，把重组真核表达载体串珠素反义cDNA质粒pAP转染喉癌细胞Hep-2。通过RT—PCR、Westernblot及MTT法检测转染后Hep-2细胞串珠素mRNA、蛋白质表达及细胞增殖水平，并观察转染后Hep-2细胞对碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）的反应性。将Hep2细胞分3组：①未转染的Hep-2细胞组（WT组）；②空载体ph8Apr—neol转染组（neo组）；③串珠素反义cDNA质粒pAP转染组（pAP组）。结果：将质粒pAP成功地转入Hep2细胞，获得了稳定表达串珠素反义cDNA基因的细胞系。串珠素mRNA和蛋白质水平在pAP组低表达，在WT组和neo组高表达，均差异有统计学意义（均P〈O．01）。在0．1％FCS的RPMI1640培养基培养下，WT组、neo组和pAP组细胞的增殖率均降低，但pAP组细胞的增殖与WT组和neo组细胞相比明显减低；在0．1％FCS加1μg／L bFGF的RPMI1640培养液培养下．WT组和neo组细胞增殖接近正常，但pAP组细胞的增殖能力较弱。结论：串珠素反义cDNA质粒转染可以有效抑制喉癌细胞Hep2的增殖能力。     

Stat3反义寡脱氧核苷酸在体外诱导喉癌细胞凋亡

目的:探讨Stat3反义寡核苷酸对人喉癌Hep-2细胞株细胞凋亡的影响。方法:设计Stat3反义寡核苷酸序列,应用脂质体瞬时转染法转染人喉癌Hep-2细胞,应用Western blot和RT-PCR检测Stat3及p-Stat3的表达;MTT实验检测Stat3反义寡核苷酸对转染细胞的抑制情况,应用DNA ladder、吖啶橙/溴化乙啶(AO/EB)及流式细胞术检测细胞凋亡水平和形态变化。结果:Western blot和RT-PCR结果显示Stat3反义寡核苷酸分别在蛋白及mRNA水平显著抑制Stat3基因表达,并在蛋白水平抑制p-Stat3表达;转染Stat3反义寡核苷酸的喉癌细胞增殖明显受到抑制,与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05);DNA ladder、AO/EB及流式细胞术证实Stat3反义寡核苷酸在体外可抑制Stat3基因表达并诱导人喉癌Hep-2细胞凋亡,且呈现浓度依赖性。结论:Stat3对喉癌细胞的过度生长、增殖起一定作用,Stat3反义寡核苷酸能够诱导喉癌细胞凋亡,抑制其增殖。     

Livin shRNA稳定转染Hep-2细胞系的建立

目的构建靶向Livin基因干扰真核表达质粒,建立干扰质粒稳定转染的Hep-2细胞系,下调Livin基因在Hep-2细胞系中的表达。方法针对Livin基因的mRNA序列设计干扰序列,分别构建1个shRNA质粒表达载体和1个阴性对照质粒,大肠杆菌扩增、酶切及测序鉴定,用脂质体介导转染Hep-2细胞,经G418筛选出稳定转染的细胞系,用Real—timePCR和Westernblot检测Livin在mRNA和蛋白水平的抑制效果。结果经测序证实成功构建pGenesil-LivinshRNA真核表达质粒。干扰质粒稳定转染的Hep-2细胞在荧光显微镜下观察,发出绿色荧光。重组质粒转染Hep．2细胞后,Livin基因在mRNA及蛋白水平明显下降,mRNA水平下调47．17％,蛋白水平下调34．25％。结论成功构建以Livin为靶向的LivinshRNA真核表达质粒。对喉癌Hep-2细胞中Livin的表达具有显著抑制效应,为研究Livin在Hep-2中的功能和喉癌的基因治疗奠定了基础。     

RNA干扰DJ-1基因抑制喉癌细胞的增殖

目的 探讨RNA干扰(RNAi)抑制喉癌Hep-2细胞DJ-1基因的表达及观察其细胞效应.方法 设计合成3对特异性针对人DJ-1基因的小干扰RNA(siRNA),脂质体法转染Hep-2细胞,实验分为4组:瞬时转染非特异性siRNA对照组及转染特异性siRNA 3组(siRNA1、siRNA2、siRNA3).采用RT-PCR检测DJ-1 mRNA,蛋白免疫印迹法检测DJ-1蛋白,流式细胞仪检测细胞凋亡及四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法检测特异性siRNA1组对Hep-2细胞效应.结果 本实验设计合成的3对特异性siRNA均不同程度地抑制DJ-1基因表达,其中特异性siRNA1组抑制效果最佳.M1Tr比色法结果显示特异性siRNAl组(终浓度50 nmo~L、100 nmolZL)对Hep-2细胞增殖具有抑制作用.流式细胞仪检测结果最示特异性siRNA1组能诱导Hep-2细胞凋亡,转染特异性siRNA1组凋亡率为(15.7±4.8)%,非特异性siRNA对照组凋亡率为(4.5±0.4)%,非特异性siRNA对照组与特异性siRNA1组凋亡率比较差异有统计学意义(t=4.736,P<0.01).结论 转染特异性siRNA组能有效抑制Hep-2细胞增殖,诱导Hep-2细胞凋亡.     

RNA干扰抑制c-Met表达对喉癌Hep-2细胞体内外生长的影响

目的 采用RNA干扰(RNAi)技术抑制人喉癌Hep-2细胞c-Met基因表达,观察对其体外生物学活性和体内生长的影响.方法 构建能够表达针对c-Met的小干扰RNA的RNAi质粒和表达不针对任何已知mRNA的siRNA的阴性对照RNAi质粒,采用阳离子脂质体Lipofectamine2000作为转染试剂将其转染人喉癌细胞株Hep-2,通过RT-PCR及Western Blot方法检测转染效率,筛选出抑制效果最好的c-Met-siRNA序列;通过四甲基偶氮唑蓝(MTT)法、运动实验及侵袭实验比较转染前后细胞的生长、运动及侵袭能力.在裸鼠喉癌皮下荷瘤模型模拟c-Met-siRNA基因治疗实验中,采用Western Blot法检测重组质粒对c-Met基因及MMP-9、VEGF基因表达的影响.结果 pSilencer2.0/c-Met-shRNA转染人喉癌细胞株Hep-2后,c-Met的mRNA和蛋白表达水平显著降低(P值分别为0.003和0.02),细胞的生长、运动及侵袭均受到明显抑制(P值分别为0.001,0.004和0.004).肿瘤接种到裸鼠后第35天,重组质粒组肿瘤体积为(138±27)mm~3,与对照组相比差异有统计学意义(P<0.01);重组质粒组瘤体内c-Met、MMP-9、VEGF基因表达率比对照组明显降低(P<0.05).结论 c-Met-siRNA能成功下调靶基因的表达,并能显著抑制喉癌Hep-2细胞的生长、运动、侵袭及移植裸鼠成瘤后的生长,siRNA表达质粒介导的基因治疗有希望成为喉癌靶向性c-Met治疗的新策略.     

染料木黄酮对喉癌Hep-2细胞系增殖和凋亡的影响

目的　探讨染料木黄酮（genistein,Gen）对人鳞状细胞喉癌Hep-2细胞系增殖和凋亡的影响。方法　用CCK-8法检测不同浓度Gen对Hep-2细胞系增殖的影响;用实时荧光定量聚合酶链反应（Real-Time PCR）检测Gen对Hep-2细胞系血管内皮生长因子受体-3（vascular endothelial growth factor receptor-3,VEGFR-3）mRNA表达的影响;用流式细胞术检测Gen单独及联合VEGFR-3特异性阻滞剂MAZ51对Hep-2细胞系凋亡的影响;Western blot检测各组AKT蛋白表达及其磷酸化水平。结果　Gen可抑制Hep-2细胞系增殖,且抑制作用呈剂量依赖性;Gen能抑制Hep-2细胞系的VEGFR-3 mRNA表达,抑制率为32%;单用Gen和MAZ51均能诱导Hep-2细胞系凋亡,二者联合应用对Hep-2细胞系的凋亡诱导作用明显增强;Gen与MAZ51均能抑制AKT第308位苏氨酸（Thr308）及第473位丝氨酸（Ser473）磷酸化激活,使p-AKT-Thr308和p-AKT-Ser473减少,两种药物合用抑制率更高。结论　Gen可通过抑制VEGFR-3表达阻止AKT磷酸化激活,并发挥抑制喉癌细胞增殖和诱导其凋亡的抗癌作用。     

稳定表达siRNA-STAT3基因Hep-2细胞系的建立

目的建立稳定表达siRNA-STAT3基因的Hep-2细胞系,为进一步探讨STAT3在喉癌中的作用机制提供基础。方法产生针对STAT3的小发卡状RNA寡核苷酸,连接到PGPU6/GFP/Neo载体,双酶切和质粒测序鉴定真核表达质粒PGPU6/GFP/Neo-siRNA-STAT3,G418筛选稳定转染细胞系,蛋白印迹法测定p-STAT3的表达。分别用MTT法绘制生长曲线和平板克隆形成实验测定单细胞增殖能力。结果构建了重组干扰质粒并筛选出了阳性克隆,蛋白印迹法鉴定STAT3被抑制后p-STAT3表达也明显下降。生长曲线显示siRNA-STAT3组3天后抑制效应才较为明显（P=0.001）,5d后抑制效应更加突出（P=0.000）,其抑制效应呈时间-效应关系。另外,siRNA-STAT3组单克隆形成率也明显低于对照组（P=0.000）。结论本研究筛选了可稳定、较高水平表达siRNA-STAT3的Hep-2细胞系。干扰STAT3表达对细胞增殖抑制的作用较为明显。     

缺氧诱导因子-1a反义寡核苷酸对喉鳞癌荷瘤裸鼠化疗的增敏作用

目的 探讨应用缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)反义寡核苷酸对荷瘤裸鼠化疗(顺铂)的增敏作用及可能的途径.方法 将肿瘤最大直径长至8～10 mm的裸鼠,选择20只随机分为四组:A组(正义+化疗),B组(反义+化疗),C组(化疗),D组(空白对照),每次注射反义寡核苷酸100μg/只(按脂质体:AS-ODN=1∶1进行包...     

靶向阻断COX-2信号通路对喉癌细胞生长的影响

目的观察赛来昔布靶向阻断COX-2信号通路对喉癌细胞生长的影响。方法用不同浓度的赛来昔布处理喉癌细胞Hep-2,通过MTT法检测赛来昔布对喉癌细胞的生长抑制率的影响。用浓度为15μmol/L的赛来昔布处理Hep-2细胞,通过流式细胞学检测药物处理前后细胞周期、凋亡率的差异,运用Western blot检测药物处理前后相关蛋白EGFR和COX-2表达的差异。结果赛来昔布处理后的Hep-2细胞与药物浓度成比例地出现生长抑制率增高;赛来昔布干预组细胞G1期比例大于对照组（P〈0.01）,凋亡率明显升高（P〈0.05）;与对照组相比,赛来昔布干预组出现明显的p-EGFR,COX-2表达降低（P〈0.05）。结论赛来昔布能抑制喉癌细胞株Hep-2生长,增加Hep-2细胞G1期阻滞,降低肿瘤细胞增殖能力和诱导细胞凋亡;赛来昔布可抑制喉癌细胞COX-2的表达和EGFR的磷酸化。提示COX-2抑制剂可能作为喉癌靶向治疗的新方法。     

siRNA沉默C-erbB-2基因对人喉癌Hep-2细胞PI3K/Akt信号通路的影响

目的：探讨siRNA沉默人喉癌Hep-2细胞C—erbB-2基因对细胞增殖的影响,及其与P13K／Akt信号通路的关系。方法：利用siRNA技术转染Hep-2细胞C—erbB-2基因,RT—PCR3检测siRNA转染后C-erbB-2mRNA的水平变化,MTT检测细胞增殖情况改变,Western blot检测ERK1／2和AKT1蛋白磷酸化变化情况。结果：转染C—erbB-2 siRNA24h后的Hep-2细胞C—erbB-2mRNA水平出现下调,细胞增殖抑制率增加,ERK1／2和AKT1蛋白磷酸化水平也相应降低,C—erbB-2基因表达与ERK1／2和AKT1蛋白磷酸化水平之间有显著相关性。结论isiRNA沉默Hep-2细胞C-erbB-2抑制Hep-2细胞增殖,这种增殖抑制可能通过降低ERK1／2和AKT1蛋白磷酸化水平实现。     

葫芦素B对喉癌细胞增殖和凋亡的影响及其机制研究

目的:体内外观察葫芦素B对人喉癌细胞系Hep-2的抑制增殖和诱导凋亡作用并探讨其作用机制,为临床应用提供实验依据.方法:用0.1、1.0、10.0和100.0 μmol/L的葫芦素B作用于Hep-2细胞24、48和72 h, MTT法检测细胞增殖.用0.1、1.0和10.0 μmol/L的葫芦素B作用于Hep-2细胞24 h或10 μmol/L葫芦素B作用8、12和24 h,流式细胞仪检测细胞周期分布和细胞凋亡率,荧光显微镜观察细胞凋亡.Western blot检测p-STAT3、cyclin B1和Bcl-2的蛋白表达.建立喉癌裸鼠移植瘤模型,观察葫芦素B的体内抑瘤作用.结果:MTT结果显示葫芦素B对Hep-2 细胞的增殖抑制作用具有明显的剂量和时间依赖性;流式细胞仪检测发现随着葫芦素B浓度增高或作用时间延长,处于G2/M期细胞的比例逐渐升高,同时伴有G0/G1期细胞减少,细胞凋亡率逐渐升高,经统计学分析,各实验组之间及其与对照组之间的均差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01);荧光显微镜观察可见典型细胞凋亡;Western blot检测显示葫芦素B可剂量依赖性抑制p-STAT3、cyclin B1和Bcl-2的蛋白表达.体内实验发现低、中、高剂量组的抑瘤率分别是32.43%、43.24%和70.27%.结论:葫芦素B通过抑制STAT3活化,抑制cyclin B1和Bcl-2的蛋白表达,引起喉癌细胞G2/M期阻滞、增殖抑制和凋亡,发挥对喉癌的抗癌效应.