核因子κB降低小鼠胚胎成纤维细胞中Lmp2基因转录

目的 研究在小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)中,核因子κB(NF-κB)对Lmp2基因转录的影响.方法 利用NF-κB荧光素酶报告基因检测MEF和c-abl/arg缺失株(DKO)中内源性NF-κB活性;构建包含Lmp2启动子序列和NF-κB结合序列突变体的荧光素酶报告基因,通过双荧光素酶报告系统,研究NF-κB对Lmp2启动子转录活性的调控,并应用定量PCR、Western印迹比较Lmp2基因在MEF和DKO细胞中表达水平.结果 DKO细胞中内源性NF-κB活性上调;DKO细胞中Lmp2基因启动子的转录活性发生下调,并且NF-κB结合序列突变后,其转录活性升高;定量PCR和Western印迹结果表明,DKO细胞中Lmp2基因mRNA和蛋白表达水平比较MEF细胞均发生下调.结论 MEF中内源性NF-κB可负调控Lmp2基因转录,并降低其蛋白表达水平.     

IL-1β诱导人气道上皮细胞hBD-2表达及其分子机制

目的观察白介素-1β(IL-1β)诱导人气道上皮细胞人β防御素-2(hBD-2)的表达及抑制因子I-κBα蛋白、核转录因子κB(NF-κB)活性的变化,探讨人气道上皮hBD-2表达的分子机制. 方法用IL-1β和(或)NF-κB抑制剂PDTC处理人原代气道上皮细胞,RT-PCR法检测hBD-2 mRNA的表达,Western blot检测胞浆I-κBα蛋白,凝胶迁移实验(EMSA)检测NF-κB活性的变化. 结果加入IL-1β 1μg/L刺激0.5h,可见I-κBα活性降低;刺激1.5h可见hBD-2 mRNA表达.NF-κB抑制剂PDTC可抑制hBD-2 mRNA的表达,EMSA显示NF-κB的异型二聚体p65-p50参与了hBD-2表达的转录.结论一定剂量的IL-1β可诱导人气道上皮细胞hBD-2 mRNA表达,NF-κB p65/p50异型二聚体参与了IL-1β诱导人气道上皮细胞hBD-2 mRNA表达的转录调控.     

IL-1β诱导人气道上皮细胞hBD-2表达及其分子机制

目的观察白介素-1β（IL-1β）诱导人气道上皮细胞人13防御素2（hBD-2）的表达及抑制因子I-κBα蛋白、核转录因子KB（NF-κB）活性的变化，探讨人气道上皮hBI〉2表达的分子机制。方法用IL-1β和（或）NF-κB抑制剂PDTC处理人原代气道上皮细胞，RT-PCR法检测hBD-2mRNA的表达，Western blot检测胞浆I-κBa蛋白，凝胶迁移实验（EMSA）检测NF-κB活性的变化。结果加入IL-1β 1μg／L刺激0．5h，可见I-κBa活性降低；刺激1．5h可见hBD-2 mRNA表达。NF-κB抑制剂PDTC可抑制hBD-2 mRNA的表达，EMSA显示NF-κB的异型二聚体p65-p50参与了hBD-2表达的转录。结论一定剂量的IL-1β可诱导人气道上皮细胞hBD-2 mRNA表达，NF-κB p65／pS0异型二聚体参与了IL-1β诱导人气道上皮细胞hBD-2 mRNA表达的转录调控。     

转染金属蛋白酶抑制剂2基因对损伤血管平滑肌细胞核因子—κB和蛋白激酶C的影响

目的探讨血管平滑肌细胞(VSMC)损伤后金属蛋白酶(MMPs)和蛋白激酶C(PKC)、核因子-κB(NF-κB)表达的变化.方法采用脂质体对VSMC转染金属蛋白酶抑制剂2(TIMP-2)基因进行基因转染,并用Western blot加以鉴定,分别用酶谱分析法、凝胶电泳迁移率分析技术(EMSA)、逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和免疫细胞化学检测该细胞克隆MMPs、NF-κB的活性变化和PKCα mRNA、蛋白的表达水平.结果体外损伤的VSMC金属蛋白酶显著增加.PKCα、NF-κB在正常VSMC中很少表达,但在损伤的VSMC中这种表达非常显著,对兔VSMC进行lIMP-2转染后,损伤的VSMC MMP-2,9活性受抑制,并且PKCα、NF-κB的表达下调(P＜0.05).结论PKCα和NF-κB在MMPs合成及损伤VSMC迁移中有重要价值,TIMP-2能通过抑制平滑肌细胞PKCα、NF-κB信号途径来防止血管再狭窄.     

MG-132活化人支气管上皮细胞表达IL-6

目的探讨核因子(NF-κB)抑制剂MG-132对支气管上皮细胞释放细胞因子白细胞介素(IL)-6的影响。方法人支气管上皮细胞系BEAS-2B细胞与MG-132(10μmol·L-1)共同培养12h,细胞核中NF-κB活性和细胞培养上清液中IL-6浓度用酶联免疫吸附试验(ELISA)方法定量,BEAS-2B细胞总IL-6mRNA表达,应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)分析。结果BEAS-2B细胞与MG-132共同培养过程中,BEAS-2B细胞IL-6mRNA上调,细胞培养上清液中IL-6释放量显著增加,而且IL-6增加量与细胞培养液中MG-132浓度呈正相关,但与NF-κB活性无关。结论MG-132可诱导BEAS-2B细胞释放IL-6,但不是通过NF-κB活化途径。     

核因子-κB和诱导型一氧化氮合酶在感染性休克大鼠肺组织中的表达及意义

目的:探讨感染性休克时大鼠肺组织内诱导型一氧化氮合酶(iNOS)和核因子-κB(NF-κB)活性变化的相关性,揭示其在感染性休克发病机制中的作用。方法:采用盲肠结扎穿孔术制备大鼠感染性休克模型,分别在术后1、6、12、24 h活杀大鼠取肺组织,用酶联免疫吸附法测定肺组织中膜NF-κB的活性,用RT-PCR和western-blot法检测肺组织中iNOS的表达。结果:感染性休克大鼠肺组织中膜NF-κB活性及iNOS mRNA和蛋白的表达均较对照组明显升高(P<0.01);NF-κB活性及iNOS mRNA和蛋白的表达呈时间依从性,术后1 h到达高峰,随后缓慢下降。结论:NF-κB是感染性休克发病机制上游的重要调控因子,其激活下游效应因子iNOS的表达是其参与感染性休克发病的重要途径。     

核因子-κB/p65 siRNA对舌鳞状细胞癌Tca8113细胞增殖、细胞周期及迁移能力的影响

目的 研究下调核因子-κB(NF-κB)/p65的表达对舌鳞状细胞癌Tca8113细胞的增殖、周期及迁移能力的影响,并探讨其相关的分子机制.方法 应用脂质体2000将NF-κB/p65 siRNA转染舌鳞状细胞癌Tca8113细胞,用Real-time PCR和Western blotting技术分别检测p65 mRNA及其蛋白的表达,采用CCK-8试剂盒和流式细胞术分别检测NF-κB/p65 siRNA对Tca8113细胞增殖和细胞周期的影响,Boyden小室法分析其对Tca8113细胞迁移能力的影响.进一步用Real-time PCR和Western blotting技术检测细胞周期相关基因cyclin E和cdk2以及浸润转移相关因子MMP-9 mRNA和蛋白表达的变化.结果 NF-κB/p65 siRNA能有效下调舌鳞状细胞癌Tca8113细胞中NF-κB/p65 mRNA和蛋白的表达(P<0.05),明显抑制Tca8113的细胞增殖(P<0.05),诱导细胞静止在G0/G1期,并降低Tca8113细胞的迁移能力.NF-κB/p65转染Tca8113后的48h,cyclin E、cdk2及MMP-9的表达均显著降低(P<0.05).结论 NF-κB/p65在舌鳞状细胞癌细胞周期及浸润转移中起重要作用,这可能与相关基因表达的改变有关.     

大鼠外伤性白内障晶体上皮细胞NF-κB mRNA表达的实验研究

目的 观察大鼠外伤性白内障形成过程中晶体上皮细胞NF-κB mRNA的表达,探讨NF-κB mRNA在外伤性白内障发病过程中的作用。方法 以大鼠晶体穿通伤建立外伤性白内障模型,用原位杂交方法检测晶体上皮细胞中NF-κB mRNA的表达,并进行相关的统计分析。结果 晶体损伤后3小时NF-κB mRNA的表达开始增强,24小时达到高峰,随后逐渐下降。结论 晶体损伤后晶体上皮细胞NF-κB mRNA的表达参与了外伤性白内障形成的病理环节。     

CPNE5对NF-κB转录调控活性的影响

目的:研究CPNE5对TNF-α诱导的NF-κB转录激活活性的影响,并探讨其作用机制.方法:用10 ng/mlTNF-α处理转染了pcDNA3.1或pcDNA3.1-CPNE5的HEK293细胞,用双荧光素酶报告基因实验检测不同转染组NF-κB的转录激活活性;Western印迹和细胞免疫荧光技术检测CPNE5表达上调对NF-κB入核的影响;凝胶阻滞实验研究CPNE5表达上调对NF-κB DNA结合能力的影响.结果:CPNE5可以显著抑制TNF-α对NF-κB的转录激活活性(P<0.0001);CPNE5不影响TNF-α诱导的NF-κB(P65)入核;CPEN5过表达降低了TNF-α诱导的NF-κB与DNA结合的能力.结论:CPNE5通过抑制NF-κB的DNA结合活性抑制TNF-α诱导的NF-κB转录激活活性.     

NF-κB在TNF-α和血管紧张素Ⅱ致内皮细胞凋亡中的作用

目的:了解NF-κB在TNF-α和血管紧张素Ⅱ导致内皮细胞凋亡中的作用。方法:用浓度为10 ng/ml TNF-α和浓度为1μmol/L血管紧张素Ⅱ分别干预内皮细胞,TUNEL法检测细胞的凋亡情况、EMSA检测NF-κB的活性和Western-blot检测IκBα的表达;用浓度检测细胞的凋亡、NF-κB的活性和IκB的表达。结果:TNF-α和血管紧张素Ⅱ显著引起了细胞的凋亡、IκBα蛋白的裂解和NF-κB的激活,用PDTC预处理后,在NF-κB活性减弱的同时抑制了细胞的凋亡。结论:在内皮细胞中,TNF-α和血管紧张素Ⅱ通过裂解胞浆内的IκBα蛋白进而激活NF-κB引起的细胞凋亡。     

创伤后单核巨噬细胞集落刺激因子调控新生血管化的分子机制

目的 观察创伤愈合过程中单核巨噬细胞集落刺激因子(granuiocyte/macrophage colony - stimulating factor,GMCSF)经ERK通路活化核因子(nuclear factor,NF) - Κb诱导创伤后人皮肤成纤维细胞（human dermal fibroblasts,HDFs）生成血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF),并探讨相关机制。方法 分离培养创伤部位HDFs,并用GMCSF处理。作用不同时间后,采用RT - PCR和ELISA分别检测HDFs VEGF Mrna和蛋白水平;应用GMCSF作用HDFs后,采用Western blot观察ERK磷酸化水平的改变;进一步应用ERK通路特异性抑制剂PD98059预处理HDFs。再用GMCSF刺激已预处理过的细胞,收集细胞和上清液,采用Western blot检测VEGF蛋白水平的变化;进一步通过抑制ERK信号通路,采用免疫荧光检测NF - Κb的活化。另外,应用核质抽提试剂盒分离胞质和胞核,采用Western blot检测NF - Κb的活化。结果 随着GMCSF浓度的增加,VEGF Mrna及蛋白水平也逐步增加,呈一定的剂量依赖性;GMCSF作用于HDFs 2 h后,VEGF Mrna水平开始升高,至4～6h达到峰值。GMCSF能够显著活化ERK磷酸化过程;与GMCSF组相比,ERK信号通路特异性抑制剂PD98059能显著抑制GMCSF诱导VEGF的表达(P＜0.05)。免疫荧光和Western blot结果显示,抑制ERK后NF - Κb的活化受到显著抑制。结论 GMCSF可通过ERK信号通路活化NF - Κb从而诱导HDFsVEGF的表达。     

NF-κBp65特异性siRNA的筛选和功能鉴定

目的:筛选有效的核因子-κB(NF-κB)p65特异性小干扰核糖核酸(siRNA),优化反应条件,用来抑制白细胞介素-1β(IL-1β)诱导的软骨细胞中一氧化氮合酶-2(NOS-2)和环氧合酶-2(COX-2)的表达,探讨siRNA技术在关节炎治疗方面的应用。方法:体外转录合成NF-κBp65特异性siRNA,质脂体转染软骨细胞,筛选出有效的siRNA。将筛选的siRNA转染培养的软骨细胞,再用IL-1β刺激诱导软骨细胞,提取蛋白质和RNA。利用RT-PCR和Westernblot从mRNA和蛋白质两水平检测NF-κBp65、NOS-2和COX-2的表达,采用凝胶电泳迁移率分析(EMSA)测定NF-κB的活性。结果:NF-κBp65特异性siRNA有效干扰NF-κBp65的表达,降低NF-κB的活性,抑制IL-1β诱导的NOS-2和COX-2的表达。结论:NF-κBp65特异性siRNA可用于关节炎治疗的实验研究。     

Effects of NF-κB1 (p50) targeted gene disruption on ionizing radiation-induced NF-κB activation and TNFα, IL-1α, IL-1β and IL-6 mRNA expression in vivo

Purpose : To investigate the role of the NF- κB1 (p50) gene in ionizing radiation (IR)-induced NF- κB activation and TNF α, IL-1 α, IL-1 β and IL-6 mRNA expression in vivo. Materials and methods : NF- κB activation was analysed by the gel shift/supershift assay and the levels of TNF α, IL-1 α, IL-1 β and IL-6 mRNA were measured using RNase protection assay (RPA). Various tissues from BALB/c, B6,129P-Nfkb1 (NF- κB1 or p50 gene knockout, p50 -/-) and B6,129PF2 (wild-type, p50 +/+) mice were analysed before or after exposure to a lethal dose (8.5 Gy) of total-body γ-irradiation. Results : Exposure of BALB/c mice to total-body IR selectively activated NF- κB in the spleen, mesenteric lymph nodes (LN) and bone marrow (BM). Gel supershift assay using polyclonal antibodies against NF- κB p50, p65 or c-Rel protein revealed that the NF- κB p50 subunit is a critical component of the NF- κB complexes activated by IR in vivo. Discretely augmented TNF α, IL-1 α, IL-1 β and IL-6 mRNA expression was found in the spleen, LN and BM after BALB/c mice received IR. However, mice lacking the p50 gene (p50 -/-) showed a significant reduction in IR-induced activation of NF- κB and increases in TNF α, IL-1 α, IL-1 β and IL-6 mRNA expression, as compared with that of wild-type mice (p50 +/+) . Conclusions : The NF- κB p50 subunit is a critical component of the NF- κB complexes activated by IR and it plays an important role in mediating IR-induced TNF α, IL-1 α, IL-1 β and IL-6 mRNA expression in vivo.     

三氧化二砷通过抑制IKK/NF-κB信号通路活化发挥促乳腺癌细胞凋亡效应

目的探讨IKK/NF-κB信号通路在三氧化二砷(As2O3)诱导乳腺癌细胞凋亡反应中的作用。方法以乳腺癌细胞MCF7为靶细胞,以As2O3为刺激源,锥虫蓝(台盼蓝)拒染方法检测死亡细胞比率;双荧光素酶报告基因法检测MCF7细胞中NF-κB的活化状态;Western印迹方法检测IKK/NF-κB途径各信号分子的表达水平和活化状态;RT-PCR方法检测IKK/NF-κB途径下游靶基因的表达水平。结果 As2O3可显著诱导MCF7细胞凋亡;同时NF-κB的转录活化水平及其下游凋亡反应相关靶基因的表达水平也明显下降。在此过程中,I-κB的表达水平和NF-κB关键组成亚基(p65、p50)的核浆分布状态没有改变,但IKK激酶的两个催化亚基IKKα和IKKβ的表达水平明显下调。一过性高表达IKKα和IKKβ不仅能够恢复NF-κB的活化状态,而且能够拮抗As2O3诱导的乳腺癌细胞凋亡反应。结论 As2O3可通过在蛋白激酶水平抑制IKK/NF-κB信号通路活化从而发挥促乳腺癌细胞凋亡效应。     

高盐诱导下以 TonEBP/NF-κB 通路为基础的小鼠巨噬细胞表型偏移机制的研究

 目的 探讨高盐刺激下巨噬细胞表型偏移的可能机制,为相关心血管疾病的防治提供新的实验依据。方法 选取Raw264.7小鼠巨噬细胞为研究对象,构建TonEBP慢病毒干扰稳定细胞株,利用Real-time PCR技术检测TonEBP干扰效率,选取干扰效率最高的感染组细胞株用于后续实验。给予各组相应干预后同步培养24 h,利用Real-time PCR检测各组细胞TonEBP、NF-κB及其M1、M2型巨噬细胞表型标志物mRNA的表达水平;Western blot法检测各组TonEBP、NF-κB、pNF-κB、pIKKα/β的蛋白表达水平。结果 成功构建TonEBP -shRNA稳定干扰细胞株,与Control组相比其TonEBP干扰效率达70％;Real-time PCR结果显示单纯高盐干预下Raw264.7细胞TonEBP、NF-κB和M1型巨噬细胞表型标志物的mRNA表达水平显著上调(P＜0.05),M2型巨噬细胞表型标志物mRNA表达水平显著下调(P＜0.05);高盐刺激下分别干扰TonEBP、NF-κB的表达后,M1型巨噬细胞表型标志物的mRNA表达水平显著下调,M2型巨噬细胞表型标志物mRNA表达水平显著上调。Western blot结果显示单纯高盐刺激下Raw264.7细胞TonEBP、p-IKKα/β、NF-κB、p-NF-κB的蛋白表达水平均明显上调,NF-κB,p-NF-κB,p-NF-κB与NF-κB比值增加;高盐刺激下分别干扰TonEBP、NF-κB的表达后,p-IKKα/β、p-NF-κB蛋白表达水平均显著下调。结论 TonEBP/NF-κB信号通路的激活是高盐刺激下Raw264.7细胞向M1型巨噬细胞发生偏移的可能机制;调节TonEBP/NF-κB信号通路,可改变高盐诱导下Raw264.7细胞表型偏移方向。     

基于TLR5-NF-κB通路筛选四物汤中的活性成分

目的基于TLR5-NF-κB通路建立报告基因系统筛选四物汤中的有效成分。方法利用脂质体转染试剂Li-pofectin 2000将含有hTLR5基因和NF-κB Luc报告基因的质粒转染入人胚肾细胞(HEK293细胞),加入药物刺激后再检测细胞荧光素酶表达水平,筛选出能够激活TLR5受体及其下游NF-κB通路的有效成分。结果果糖、腺嘌呤能够显著激活此通路,且随果糖、腺嘌呤作用浓度的增加对细胞膜表面TLR5受体及其下游的NF-κB通路激活作用也随之增强,叶酸、东莨菪内酯、芍药苷、盐酸川芎嗪、β-谷甾醇、阿魏酸也能一定程度激活此通路。结论通过TLR5受体介导NF-κB通路激活剂筛选模型,筛选出四物汤内果糖、腺嘌呤、芍药苷、盐酸川芎嗪、叶酸、东莨菪内酯、β-谷甾醇、阿魏酸8种单体在一定浓度范围内能够激活TLR5受体及其下游的NF-κB通路。     

黏蛋白3羧基末端蛋白酶切的阻断及N-糖基化的抑制对其细胞膜定位的影响

目的探讨大鼠黏蛋白3(rMuc3)羧基端蛋白酶切反应和羧基端内N-糖苷型糖链与细胞膜定位的关系。方法利用脂质体将包含rMuc3羧基端的3个真核表达载体p20、p20t和p20s/a导入COS-1细胞,并采用N-糖苷型糖链合成抑制剂衣霉素处理转染后的COS-1细胞,抑制其表达蛋白质的N型糖链合成。采用免疫荧光定位法,用抗V5抗体和抗Myc抗体检测Muc3蛋白的表达。结果在甲醇固定的COS-1细胞,细胞核周和细胞表面均能检测到完整的Muc3羧基端p20表达产物;在未经甲醇固定的COS-1细胞,免疫荧光仅限于细胞表面。缺失的rMuc3羧基端的p20t表达产物仅能在细胞核周检测到。Muc3羧基端建立的蛋白酶切阴性突变体p20s/a与p20转染细胞的荧光分布相近。衣霉素抑制糖链合成后不影响膜定位。结论Muc3羧基末端蛋白酶切的阻断及N-糖基化的抑制不能影响Muc3的细胞膜定位,影响其定位的因素主要是SEA组件靠近羧基端的区域,包括该分子的跨膜区和胞质内区域。     

三氧化二砷通过抑制IKK/NF-κB信号通路活化发挥促乳腺癌细胞凋亡效应

目的探讨IKK/NF-κB信号通路在三氧化二砷（As2O3）诱导乳腺癌细胞凋亡反应中的作用。方法以乳腺癌细胞MCF7为靶细胞,以As2O3为刺激源,锥虫蓝（台盼蓝）拒染方法检测死亡细胞比率;双荧光素酶报告基因法检测MCF7细胞中NF-κB的活化状态;Western印迹方法检测IKK/NF-κB途径各信号分子的表达水平和活化状态;RT-PCR方法检测IKK/NF-κB途径下游靶基因的表达水平。结果 As2O3可显著诱导MCF7细胞凋亡;同时NF-κB的转录活化水平及其下游凋亡反应相关靶基因的表达水平也明显下降。在此过程中,I-κB的表达水平和NF-κB关键组成亚基（p65、p50）的核浆分布状态没有改变,但IKK激酶的两个催化亚基IKKα和IKKβ的表达水平明显下调。一过性高表达IKKα和IKKβ不仅能够恢复NF-κB的活化状态,而且能够拮抗As2O3诱导的乳腺癌细胞凋亡反应。结论 As2O3可通过在蛋白激酶水平抑制IKK/NF-κB信号通路活化从而发挥促乳腺癌细胞凋亡效应。     

具有多种剪接形式的RNA结合蛋白基因的克隆、表达及其细胞内定位

目的：构建具有多种剪接形式的RNA结合蛋白（RBPMS）基因的真核表达载体,并在真核细胞中进行表达,确定RBPMS在细胞中的定位.方法：采用PCR技术,从人卵巢文库中扩增RBPMS基因的完整编码序列,将所扩增基因克隆到带FLAG标签的真核表达载体上,转染人胚肾细胞293T,Western印迹鉴定RBPMS的表达.然后将所扩增基因克隆到带绿色荧光标签的pEGFP-C1表达载体上,转染乳癌细胞ZR75-1,观察RBPMS在细胞中的定位情况.结果：经限制性内切酶分析和DNA序列测定鉴定构建的重组表达载体正确,Western印迹实验证明RBPMS表达成功,通过激光共聚焦显微镜观察,RBPMS分布在胞质中,在40%～50%细胞中RBPMS呈聚集状分布.结论：成功构建了RBPMS基因的真核表达载体,该基因产物分布在胞质中,在40%～50%细胞中RBPMS呈聚集状分布.     

核因子-κB在大鼠肺型氧中毒发病中的作用

目的 探讨核因子(NF)-κB在大鼠肺型氧中毒发病中的作用.方法 32只SD大鼠随机分为正常对照组及230 kPa高压氧暴露2、6、10 h组.观察肺组织病理变化以及NF-κB和肿瘤坏死因子a(TNF-α)在肺组织中含量的变化.结果 (1)病理检查发现肺组织在高压氧暴露6 h组出现炎症改变,10 h组肺损伤加重.(2)肺组织细胞核中NF-κB P65含量在高压氧暴露2 h组中明显增高,6 h组中达高峰,10 h组中下降但仍高于正常对照组.(3)肺组织TNF-α mRNA表达及肺匀浆中TNF-α浓度在高压氧暴露6 h组中明显增高,10 h组中继续增高.结论 高压氧可以通过活化NF-κB诱导TNF-α高表达从而介导氧中毒的肺损伤.